[发明专利]一种多靶点基因检测甲型H1N1流感病毒变异株的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测甲型H1N1流感病毒变异株的试剂盒，该试剂盒含有如下的多组引物：

一组针对M基因检测所有甲型流感病毒的引物，其序列如下所示：

1)5’-GAA TGG CTA AAG ACA AGA CC-3′(SEQ ID NO：1)

2)5’-GCT GCA GTC CTC GCT CAC T-3’(SEQ ID NO：2)

其中序列1)和2)分别为检测所有甲型流感病毒M基因的正义引物和反义引物,反义引物的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)；

一组针对HA基因检测所有H1N1的流感的引物，其序列如下所示：

3)5’-GCA GAT CAA AAG AGC ACA CAA AAT-3′(SEQ ID NO：3)

4)5’-CCA AAG TTC TTT CAT TTT CCA AT-3’(SEQ ID NO：4)

其中序列3)和4)分别为检测所有H1N1流感病毒HA基因的正义引物和反义引物,反义引物的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)；

一组针对HA基因检测甲型H1N1流感病毒2009变异株的引物序列，其序列如下所示：

5)5’-CAT TCG CAA TGG AAA GAA A-3′(SEQ ID NO：5)

6)5’-TCC TCA ATC CTG TGG CCA G-3’(SEQ ID NO：6)

其中序列5)和6)分别为检测甲型H1N1流感病毒(2009变异株)HA基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)；

一组针对人类beta-2-microglobulin基因检测样品中人体组织的引物序列，其序列如下所示：

7)5’-CCA GCA GAG AAT GGA AAG T-3′(SEQ ID NO：7)

8)5’-GAT GCT GCT TAC ATG TCT CG-3’(SEQ ID NO：8)

其中序列7)和8)分别为检测人类beta-2-microglobulin基因的正义引物和反义引物，反义引物的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有如下的成分：

（1）、RT-PCR反应液，包括1-10×RT缓冲液、SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7正义引物混合、RT-PCR酶和dNTP;

（2）、PCR反应液，包括1-10×PCR缓冲液、MgCl₂、SEQ ID NO：1-8共8种引物混合、Taq DNA聚合酶和dNTP；

（3)、纯水；

（4)、阴性对照：流感病毒阴性样品RNA；

（5)、阳性对照：甲型H1N1流感病毒2009变异株阳性样品RNA。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，RT-PCR反应液中RT缓冲液反应终浓度为1X；引物反应终浓度为0.05umol/L–0.5umol/L；RT-PCR酶反应终浓度为2U-10U（20ul/反应）；dNTP反应终浓度为0.1mmol/L–0.6mmol/L。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，10×RT缓冲液组成为750mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT、500mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，RT-PCR反应液中PCR缓冲液反应终浓度为1X；MgCl₂反应终浓度为1.0mmol/L-3.0mmol/L；引物反应终浓度为0.05umol/L–0.5umol/L；PCR酶反应终浓度为0.2U-5U（20ul/反应）；dNTP反应终浓度为0.1mmol/L–0.6mmol/L。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，10×PCR缓冲液的组成为：500mmol/L KCl、100mmol/LTris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0％Triton X-100。