[发明专利]一种检测绵羊高繁殖力基因BMPR1B的分子诊断方法

说明书

技术领域

本发明涉及绵羊高繁殖力基因BMPR1B突变位点A746G的基因型分析方法。本发明采用等位基因特异PCR（allele specific PCR, AS-PCR）的方法，该方法能够准确、快速、简便地检测BMPR1B基因突变位点A746G，包括根据突变位点设计特异引物和基因型的分析方法。

背景技术

绵羊繁殖力直接影响养羊生产的经济效益。绵羊属单胎哺乳类动物，但某些绵羊品种却具有稳定的多胎性能，如中国的湖羊、小尾寒羊以及国外的布鲁拉美利奴羊(Booroola Merino)、芬兰兰德瑞斯羊（Finnish Landrace）、罗曼诺夫羊（Romanov sheep）等品种。随着分子生物学技术的发展，一些高效的分子标记被应用于绵羊多胎性的研究，并产生了许多有效、快速的检测手段。其中PCR-RFLP、PCR-SSCP、AFLP以及利用四引物扩增受阻突变体系PCR等技术在绵羊高繁殖力候选基因的鉴定上得到了广泛的应用。

大量研究证明，BMPR1B基因具有促进排卵和增加产羔数的作用.。在绵羊BMPR1B基因的分子诊断方面，目前通常采用PCR-RFLP的方法，即通过PCR扩增包含多态位点的DNA片段，利用核酸限制性内切酶识别该突变位点的特点，通过PCR产物纯化、酶切获得基因型。同时，国内也有使用基因芯片检测BMPR1B基因A746G突变位点的专利申请（201110126709.2）。这两种方法需要使用核酸限制性内切酶或基因芯片等特殊材料，增加了检测成本和操作步骤。本发明利用AS-PCR方法，直接通过PCR扩增获得基因型，是一种快速、简便、高效的分子诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确的检测绵羊高繁殖力BMPR1B基因的分子诊断方法。本方法从引物设计和优化PCR反应步骤着手，运用AS-PCR策略，避免了传统检测方法中限制性内切酶或基因芯片的使用，在PCR扩增后直接进行琼脂糖凝胶电泳分析，获得基因型结果。

本方法的工作原理：Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切核酸酶活性，在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少。针对已知突变位点设计适当的引物，可以通过PCR方法直接达到区分突变型与野生型基因的目的。本发明通过PCR扩增绵羊BMPR1B基因突变位点A746G在内的DNA片段，分别使用设计的两组特异引物（第一组为公共正向引物与野生型反向引物，第二组为公共正向引物和突变型反向引物）。电泳检测所得到的两组扩增产物，按照如下方法确定待测样品的基因型：如果只有第一组扩增产物检测出131bp目的条带，所述待测绵羊的基因型为++，即为野生型纯合体；如果只有第二组扩增产物检测出131bp目的条带，所述待测绵羊的基因型为BB，即为突变型纯合体；如果两组扩增产物均能检测出131bp目的条带，则所述待测绵羊的基因型为B+，即为杂合体。

具体实施方式  以下实施方案将对本发明做进一步的详细说明：

一、总DNA来自绵羊血液，其提取的方法如下：

(1) 向1.5mL离心管（EP管）中加入200 μL血样。加入500ul SNET（1% SDS，400 mM Nacl，5 mM EDTA，20 mM Tris-cl PH8.0），混匀。

(2) 向以上溶液中加入蛋白酶K至终浓度100ng/mL，混匀。

(3) 55℃孵育4h。

(4) 加入等体积的Tris-饱和酚，缓慢颠倒离心管数次，12000g 离心10min。

(5) 取水相于新的EP管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，震荡摇匀10min，12000g 离心10min。

(6) 取水相于新的EP管中，加入1/10体积的3M NaAc及 2.5倍体积的无水乙醇，摇匀，-20℃静置30min，12000g 离心10min。

(7) 去水相，干燥后用适量的超纯水溶解，获得DNA提取液用于下一步的PCR扩增。

二、AS-PCR分析

1、  引物设计：

使用Primer premier version 5设计引物，引物如下：

公共正向引物: 5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'；

突变型反向引物（突变型G）：5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCC-3'；

野生型反向引物（野生型A）：5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCT-3'。

扩增片段长度为131bp。