[发明专利]基于DPO引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于DPO引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒。 

背景技术

布氏杆菌属（Brucella）是一类革兰氏阴性短小杆菌，可感染多种家畜和野生动物，主要引起母畜传染性流产。同时也可感染人，特别是羊布氏杆菌对人的威胁最大，引起相似的临床症状和病理损伤，如睾丸炎或附睾炎、不育、生殖器官及胎膜发炎、流产、不孕、关节炎、气管炎及各种组织的局部病灶等，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。 

    现有的布氏杆菌检测方法： 细菌学检测，初步分离时，须在5%~10%二氧化碳环境中才能生长，且待检样本中必须存在大量活菌才能被分离出，细菌培养周期长，因此该检测方法已逐渐被淘汰。 血清学检测，凝集试验操作简便、检测时间短，但由于IgM在中性或弱酸性时凝集能力最活跃，所以凝集试验往往因抗体的交叉反应易出现假阳性结果，2000年OIE取消了凝集试验作为布氏杆菌病的诊断方法；沉淀试验由于人为进行结果观察，所以存在判定结果的主观性，有时会出现误判，也不是一种理想的检测方法；补体结合试验主要用以检测牛、羊和猪布氏杆菌病，操作中对温度和试剂滴加量要求高，也无法避免假阳性结果。 变态反应，主要用于山羊和绵羊检疫，但山羊的变态反应不如绵羊变态反应易判定结果，仅对中、后期病山羊的诊断意义较大，适于山羊布氏杆菌病的筛检，不作个体的诊断依据。 ELISA方法，竞争ELISA尚无诊断标准，间接ELISA是一种先进、快速、可靠的检测方法，但存在无法区别疫苗抗体与致病株抗体的不足。 PCR方法，是用于细菌DNA检测最可靠的方法。PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到了广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等，而PCR引物的设计又成为了制约该类检测方法成败的关键性因素。常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，以防止非特异性扩增，特别是涉及多重PCR时，需要大量的实验以验证检测方法的特异性，费时又费力。 

双启动寡核苷酸引物（Dual priming oligonucleotide，DPO）的设计方法简化了建立常规PCR方法的操作步骤。该DPO引物的设计分为两部分，中间用多聚次黄嘌呤肌苷连接，5'-端长18-25bp，3'-端长6-15bp。由于该类引物特殊的结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，试验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化。同时，DPO引物与模板发生错配的几率小，因为只要有3个以上碱基发生错配，就不会成功扩增，比常规PCR引物的特异性更强，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其检测结果比常规PCR方法更为精确。 

在此情况下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法对布氏杆菌实施精准检测，对保障公共卫生安全具有重要意义。本发明根据布氏杆菌属（Brucella）Omp25靶基因的保守区设计合成了DPO鉴定引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了布氏杆菌DPO-PCR精准检测方法。本发明可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。 

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种基于DPO引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒。 

本发明所采用的技术如下： 

一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用引物对， 

上游引物BO-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物BO-DPOR：如序列表Seq No.2所示。

本发明还具有如下特征： 

1、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物，

上游引物BO-F：如序列表Seq No.3所示，

下游引物BO-R：如序列表Seq No.4所示。

2、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-Omp25，如序列表Seq No.5所示。 

3、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-Omp25的制备方法，包括以下步骤： 

（1）、PCR模板的制备：布氏杆菌基因组DNA的提取和纯化；