[发明专利]一种高通量全基因组DNA甲基化检测技术

说明书

技术领域

本发明属于DNA甲基化检测技术领域，具体涉及一种高通量全基因组DNA甲基化检测技术。

背景技术：

DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组DNA的一种重要的表观遗传学修饰，即在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基集团共价结合到DNA分子的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-^mC)的过程。DNA甲基化在维持高等生物正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育、衰老以及人类肿瘤的发生等生物学过程中起着重要作用。在无脊椎动物中，基因组DNA甲基化通过调控基因的表达模式，参与调节机体对环境的适应过程。因此，获得全基因组范围内所有胞嘧啶位点的甲基化数据，对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。

随着甲基化研究的不断深入，已经有多种甲基化分析方法以满足不同甲基化研究的需要。在针对全基因范围DNA甲基化的研究中，检测的手段主要是基于芯片平台的全基因组甲基化位点的筛选和基于高通量测序平台的甲基化图谱分析。其中芯片技术在模式生物的甲基化研究中是相对完善成熟的检测工具，具有高覆盖度、方便快捷，性价比高等特点，如 Illumina推出的人类全基因组甲基化芯片Human Methylation HD 450包含45万个CpG位点，能够覆盖所有NCBI注释的基因。操作流程简单，能够进行高通量甲基化位点的准确检测。但针对遗传信息相对匮乏的非模式生物，其芯片造价昂贵，甲基化位点选择的灵活性不高，因而难以利用现有芯片平台对非模式生物进行高通量全基因组甲基化的研究。

随着新一代测序技术通量不断提高和成本的降低，目前有很多基于二代测序平台的全基因组甲基化检测方法以得到应用，包括有全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing，BS-seq) 和简化的表达重亚硫酸盐测序 (reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)、甲基化DNA 免疫共沉淀测序(methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq)、甲基化DNA 富集结合高通量测序(methylated DNA binding domain sequencing, MBD-Seq) 和甲基化敏感性限制酶测序(methylation-sensitive Restriction Enzyme sequencing,MRE-seq)等。这些技术都有其优缺点和适用范围，如基于亚硫氢酸盐处理的DNA甲基化检测方法, 尽管作为DNA甲基化检测的金标准，但操作复杂（重亚硫氢酸盐处理），测序所需的成本较高，不适用于贝类等基因组较大的物种。 MeDIP-Seq是对特异性抗体富集的基因组上的甲基化区域进行高通量测序从而获得全基因组范围的甲基化位点。但该技术需要大量DNA，并且抗体的价格昂贵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量全基因组DNA甲基化检测方法，即一种适用于非模式生物的，低成本、简单快速的高通量全基因组甲基化检测方法，以弥补现有技术的不足。

本发明的全基因组DNA甲基化检测方法，包括如下的步骤：

1）将基因组DNA用内切酶FspEI酶进行酶切，获得酶切片段；

2）将酶切片段的两端分别连接上接头，作为扩增引物的结合点；

3）将连接上接头的酶切片段用引物进行第一轮PCR扩增，从而富集接头连接正确的酶切片段；

4）将第一轮PCR扩增产物经凝胶纯化后用引物进行第二轮PCR扩增，引入Barcode来构建测序文库；

5）测序文库进行测序；将测序数据进行分析得到全基因组甲基化信息。

其中，步骤2）中的接头，为接头slx1和slx2，其中构成slx1的两个核苷酸片段，其序列分别为5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′（SEQ ID NO:1）和3′-CGAGAAGGCTAGANNNNN-5′（SEQ ID NO:2），其中N为碱基A、T、G、C中的任一个；

构成slx2的两个核苷酸片段，其序列分别为5′-GTGACTGGAGTTCAGAC

GTGTGCTCTTCCGATCT-3′（SEQ ID NO:3）和3′-CGAGAAGGCTAGANNNNN-5′ （SEQ ID NO:2）。