[发明专利]用于检测百合无症病毒的引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于RT-PCR检测百合无症病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

百合无症病毒属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus),暂时无科。主要分布在瑞典、英国、德国、丹麦、荷兰、比利时、意大利、拉脱维亚、美国、加拿大、日本等国家。

限于百合科，多为系统侵染。LSV一般不会造成明显症状，但会造成百合采后下部叶片提前黄化，影响瓶插寿命，与黄瓜花叶病毒（CMV）复合侵染时，可造成脉明、花叶、畸形、坏死斑等症状。自然条件下由蚜虫非持久性传播，介体蚜虫有棉蚜、桃蚜，百合汁液和种子不传。

病毒粒子弯曲状，大小为640X17-18nm，外壳分子量为32KD,由292个氨基酸组成，核酸约占粒体重的8.3％，由单一RNA组成。病毒颗粒沉降系数为172S,A260/280=1.20-1.43，致死温度为65-70℃，稀释限点为10^-5。

LSV为RNA病毒，其基因组全长8393bp，共有6个开放阅读框（ORF），只编码5个蛋白，从5’端到3’端分别为25KD、12KD、7KD、32KD和16KD，其中最长的ORF为876bp，编码32KD病毒外壳蛋白。

现有用于RT-PCR检测百合无症病毒的引物其特异性相对不够强，灵敏性相对较差，这往往会造成检测结果准确性不高。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于RT-PCR检测百合无症病毒的引物以及包含该引物的试剂盒及方法，利用该引物及检测方法检测百合无症病毒准确性高，特异性强、灵敏性高。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种用于检测百合无症病毒的引物，其特征在于：

引物序列：

LSV Primer-1:5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'，

LSV Primer-2:5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。

一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：

其中所述的LSV Primer-1序列为5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'；所述的LSV Primer-2序列为5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。

如上所述的一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于所述的Enzyme Mix包括反转录酶、PCR扩增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制剂；所述的Buffer包括MgCl₂25mM、dNTPs10mM；所述Positive Control为百合无症病毒的核酸；所述RNase Free dH2O为除去RNA酶后的去离子水。

一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A、待测样品RNA提取，得模板RNA溶液；

B、将步骤A中的模板RNA溶液反转录成cDNA，再采用引物LSV Primer-1和LSV Primer-2对进行PCR扩增，得PCR反应液；其中所述的LSV Primer-1序列为5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'；所述的LSV Primer-2序列为5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'；

C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析；

D、若存在297bp的DNA条带，则证明所检测用品中带有百合无症病毒。

本发明中所述297bp的DNA条带序列为：

AAGATGAAAGTTGGCGTCGTATCTAACAACATGGCAACCACTGAACAAATGGCCA AGATAGCGTCAGACATCGCAGGGCTTGGGGTACCAACGGAGCACGTCGCGTCAGTAATA TTGCAAATGGTCATCATGTGTGCTTGCGTGAGCAGTTCTGCGTTCCTTGACCCTGAGGG CAGCATTGAGTTTGAGAATGGAGCGGTGCCCGTCGACTCCATCACTGCGATCATGAAGA AGCACGCTGGACTGCGGAAAGTCTGCCGGCTCTATGCCCCTATCGTGTGGAACAGCATG CTTGTG。

如上所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤A中所述待测样品RNA提取，具体包括如下步骤：

a1、选取0.1-0.2g表现可疑症状的百合叶片组织，同时用等量健康组织作为对照；将百合叶片组织加液氮冷冻，充分研磨后装入1.5mL离心管中；