[发明专利]用于检测百合无症病毒的引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测百合无症病毒的引物，其特征在于：

引物序列：

LSV Primer-1:5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'，

LSV Primer-2:5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。

2.一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：

其中所述的LSV Primer-1序列为5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'；所述的LSV Primer-2序列为5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'。

3.根据权利要求2所述的一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于所述的Enzyme Mix包括反转录酶、PCR扩增用的Taq聚合酶、RNA酶抑制剂；所述的Buffer包括MgCl₂25mM、dNTPs10mM；所述Positive Control为百合无症病毒的核酸；所述RNase Free dH2O为除去RNA酶后的去离子水。

4.一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A、待测样品RNA提取，得模板RNA溶液；

B、将步骤A中的模板RNA溶液反转录成cDNA，再采用引物LSVPrimer-1和LSV Primer-2对进行PCR扩增，得PCR反应液；其中所述的LSV Primer-1序列为5'-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3'；所述的LSV Primer-2序列为5'-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3'；

C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析；

D、若存在297bp的DNA条带，则证明所检测用品中带有百合无症病毒。

5.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤A中所述待测样品RNA提取，具体包括如下步骤：

a1、选取0.1-0.2g表现可疑症状的百合叶片组织，同时用等量健康组织作为对照；将百合叶片组织加液氮冷冻，充分研磨后装入1.5mL离心管中；

a2、在离心管中加入冰冷的400μL RNA抽提液，颠倒混合均匀；

a3、台式冷冻离心机4℃，12000g离心10min；

a4、取上清，加入400μL苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1，颠倒混合均匀；

a5、台式冷冻离心机4℃，12000g离心10min；

a6、取上清，加入400μL氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿、异戊醇的体积比为24:1，颠倒混合均匀；

a7、台式冷冻离心机4℃，12000g离心10min；

a8、取上清，加入1000μL无水乙醇和40μL3M醋酸钠pH5.2，颠倒混合均匀；

a9、台式冷冻离心机4℃12000g离心10min；

a10、留沉淀，用500μL70%冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于20μL无RNA酶的水中。

6.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述模板RNA溶液反转录成cDNA，具体包括以下步骤：

在0.5mL离心管中加入去离子水9.5μL，加入总RNA2μL，Primer-2引物1μL，浓度为10mmol/L的dNTPs1μL，70℃水浴5min后立即置于冰上2min；然后3000rpm离心30s；再加入5×cDNA第一链合成缓冲液4μL，0.1mol/L DTT1μL；RNase抑制剂1μL(30U)；M-MLV反转录酶1μL(20U)；37℃60min。

7.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述PCR扩增具体包括以下步骤：

在0.2mL离心管中加入10×PCR扩增缓冲液2.5μL，浓度为25mmol/L的MgCl₂2μL，浓度为10mmol/L的dNTPs1μL，Primer-11μM（50pmol），Primer-21μM（50pmol），cDNA第一链合成反应液2μL，加水至25μL，然后加入Taq聚合酶0.5μL(1U)；PCR循环条件：94℃变性3min；然后94℃1min，52℃1min，72℃1min，循环35次；最后72℃延伸10min；4℃保存反应产物。

8.根据权利要求4所述的一种检测百合无症病毒的检测方法，其特征在于步骤C中所述琼脂糖凝胶电泳分析具体包括以下步骤：

c1、用1×TAE缓冲液和琼脂糖按1.5%的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60℃；

c2、加入I核酸染料或浓度为1μg/mL的溴化乙锭,混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳；

c3、待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲；

c4、取1μL加样缓冲液与5μL PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中；

c5、接通电源进行电泳，电压5V/cm；

c6、当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳；将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。