[发明专利]千层金再生体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明所属的技术领域为生物技术领域，进一步，本发明涉及一种千层金再生体系的建立方法。

背景技术

千层金(Melaleuca bracteata)，桃金娘科白千层属常绿乔木。其主干直立，嫩枝红色，枝条密集且细长柔软，金黄或鹅黄色叶片密集分布于锥形树冠，树形十分优美，且分枝性能好，耐修剪，生长速度快，广泛用于庭院景观、小区绿化、道路美化等。千层金除极富观赏价值外，还有极高的经济价值，枝叶均为插花的上好材料，叶片芳香宜人，其芳香油是最珍贵的天然化妆品香料之一，同时也是一种优良的天然抗菌剂，广泛用于医药、化妆品、日用化工等行业。千层金是目前世界上最流行且视觉效果最好的彩叶芳香乔木新品种，其市场前景十分广阔。

目前千层金多采用扦插或嫁接等传统无性繁殖的方法生产种苗，且国内外关于千层金的报道较少，迄今尚未见到关于建立千层金离体叶片再生体系及转基因技术相关研究报道。

发明内容

本发明提供了一种千层金再生体系建立的方法，为通过千层金离体叶片建立千层金高效遗传转化体系奠定基础，同时也为今后选育千层金优良品种提供技术参考。

一种千层金再生体系建立的方法，包括下列步骤：

（1）将外植体千层金无菌苗幼嫩叶片从叶柄处切下，接种到含有激素的MS愈伤组织诱导培养基中，培养12-15天；

（2）再在含有激素的MS愈伤组织继代培养基中培养25-30天；

（3）将愈伤组织接种至含有激素的MS分化培养基上进行分化培养；

（4）待不定芽长至2-3cm时，将其切下，接种至MS基础培养基里进行壮苗培养；

（5）待不定芽长至4-5cm时，将其接种至含有激素的MS生根培养基上进行生根培养；

（6）待不定芽根系长出后，将其炼苗移栽。

所述愈伤组织诱导培养基中的激素为0.01～0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05～0.1mg/L的萘乙酸，或者0.5～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤；

所述愈伤组织继代培养基中的激素为0.01～0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05～0.1mg/L的萘乙酸，或者0.5～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.05～0.1mg/L的萘乙酸；

所述分化培养基中的激素为0.01～0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05～0.1mg/L的萘乙酸，或者0.5～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.05～0.1mg/L的萘乙酸；

所述生根培养基中的激素为0.1～1.0mg/L的吲哚丁酸。

其中1LMS培养基的组成为：硝酸钾(KNO₃)1900mg，硝酸铵(NH₄NO₃)1650mg，氯化钙(CaCl₂·2H₂O)440mg，硫酸镁(MgSO₄·7H₂0)370mg，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)170mg，硫酸锰(MnS0₄·4H₂0)22.3mg，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂0)8.6mg，硼酸(H₂BO₃)6.2mg，碘化钾(KI)0.83mg，钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂0)0.25mg，乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA.2H₂O)37.25mg，硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂0)27.8mg，硫酸铜(CuSO₄·5H₂0)0.025mg，氯化钴(COCl₂·6H₂0)0.025mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，盐酸硫胺素(维B1)0.1mg，盐酸吡哆素(维B6)0.5mg，甘氨酸2mg，pH值5.80。

优选：所述愈伤组织诱导培养基中的激素为0.01mg/L的噻重氮苯基脲、0.1mg/L的萘乙酸；所述愈伤组织继代培养基中的激素为0.01mg/L的噻重氮苯基脲、0.1mg/L的萘乙酸；所述分化培养基中的激素为0.02mg/L的噻重氮苯基脲、0.2mg/L的萘乙酸；所述生根培养基中的激素为0.2mg/L的吲哚丁酸。

所述外植体在进行愈伤组织诱导之前，划出横向或纵向深至表皮的伤口。