[发明专利]一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细菌鉴定领域，具体涉及一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒及其应用。

背景技术

引起奶牛乳房炎的病原菌较常见的有20多种。但国内外学者的大量研究结果表明临床上以葡萄球菌和链球菌感染引起的乳房炎较为常见，约占总致病菌的90％-95％。其中无乳链球菌引起的乳房炎在乳房炎总发病率中占非常大的比例。李宏胜等(2004)从2858份临床型、隐性乳房炎奶样和健康奶样中分离鉴定出与乳房炎有密切关系的病原菌12种1968株，其中无乳链球菌总检出率最高(38.47%)，并且证实无乳链球菌可引起奶牛的急性、亚急性和慢性乳房炎，而且临床上经常导致乳房炎经久不愈，给奶牛业造成非常严重的损失。黄瑛等(2007)从临床型乳房炎的105份样品中分离到76株病原菌，其中无乳链球菌所占比例高达76.32%。邓海平等(2009)从内蒙古地区采集的100份奶样中分离到124株致病菌，其中无乳链球菌和金黄色葡萄球菌所占比例最高，均为29.03%。易明梅等(2009)从在上海郊区4个奶牛场采集的临床型和隐性乳房炎患牛的126份奶样中共分离到3种主要病原菌107株，其中无乳链球菌占分离菌株的25.23%。王旭荣等（2012）对山西采集的76份乳房炎奶样中分离的无乳链球菌所占比例为11.24%。可见，无乳链球菌在奶牛乳房炎致病病原中占有非常重要的地位。

无乳链球菌不仅是引起奶牛乳房炎的主要病原菌，也是引起人类新生儿发病和死亡的最重要感染病原，该病原菌在人医上亦称B群链球菌(GBS)，主要引起婴幼儿的肺炎、脑膜炎、败血症等。资料显示，在非怀孕成人中，侵袭性GBS病的发病率有所增加，这些病例大多见于有糖尿病、神经损伤、乳腺癌和肝硬化等疾病的人，65岁以上成人死于侵袭性GBS病的危险性最高。而且GBS作为在非妊娠女性和男性泌尿生殖道感染病原菌的作用也受到了医务人员的重视。林伟华等(2010)在58份链球菌阳性样品中检出B型无乳链球菌阳性率为33%。众多研究发现GBS出现了不同耐药谱的菌株，而且不同地区和不同部位分离的GBS的耐药谱和耐药程度都不太相同，但值得注意的是GBS的耐药谱在不断增大，对青霉素、红霉素、林可霉素等多种药物的耐药率呈上升趋势。牛源性无乳链球菌的耐药谱也在扩大，耐药强度增加，对青霉素、氨苄青霉素、链霉素、红霉素、恩诺沙星和复方新诺明等有了较强的耐药性，其耐药率有的甚至高达61.74%-85.22%。

目前对于牛源性无乳链球菌的鉴定主要还是以形态学观察和生化鉴定为主，而PCR扩增和基因测序等方法在临床上使用的还很少。国内外学者研究结果表明，对于无乳链球菌的鉴定，单纯使用一种方法去鉴定都不可避免出现结果不确定及准确率不高的问题。因此，要准确鉴定该菌必须应当考虑到联合应用这些方法。目前临床上使用最多的形态学观察和生化鉴定的程序繁琐复杂，主要包括细菌分离、镜检、纯化、生化反应及结果判断等。常规生化鉴定项目主要包括七叶苷、CAMP反应、马尿酸钠、甘露醇、山梨醇、甘油、美兰牛奶、6.5%NaCl、PH9.6肉汤和胆汁等十多项试验。使用商品化生化检测试剂，即使试验顺利也需要7-10天才能获得全部的生化鉴定结果，如果试验不顺利或者样品增多所花费的时间会更长，而且有些病原菌还会出现无法判定结果的情况。而目前国际上通用的梅里埃API细菌鉴定试剂条（生化鉴定）与本发明鉴定所需时间差不多，但也存在操作复杂，鉴定成本昂贵，鉴定结果有时会出现不确定性的缺陷。单纯的PCR有时会出现非特异性条带的干扰出现结果不准确的现象。基因测序虽然准确率很高，但存在成本高、时间长等缺陷，影响了其在临床上的大量推广使用。

中国发明专利申请CN201210368104公开了一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，通过反转录的方法将菌体内单拷贝的cfb基因转变为多拷贝，再通过环介导等温扩增技术对目标基因进行检测，从而大大提高检测灵敏度。中国发明专利申请CN201210260204公开了一种应用环介导等温扩增技术快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及检测方法，可用于鱼类养殖场的病原检测。中国发明专利申请201110169835.6的专利公开了一种主要是针对鱼源无乳链球菌的一种检测方法。中国发明专利申请200580031188公开了一种采用酯酶活性来检测无乳链球菌，其特征在于使用含有至少一种酯酶酶促底物的反应培养基。中国发明专利申请200580031157.X公开了一种采用α-葡糖苷酶活性检测无乳链球菌，特征是使用含有至少一种α-葡糖苷酶酶促底物的反应培养基来检测和鉴定无乳链球菌。 

发明内容