[发明专利]一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括以下试剂：绵羊脱纤血平板、3%H₂O₂、金黄色葡萄球菌株、特异性PCR反应液、阳性对照DNA。

2.根据权利要求1所述的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒，其特征在于，所述特异性PCR反应液由Premix Ex Taq酶、引物P1、引物P2组成；

所述引物序列为：

P1：5′-CTATTGACATCGACAATGGCAGC-3′；

P2：5′-ATACGTGAACGTGGTCATAGTGG-3′；预期扩增片段为1270 bp。

3.一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒在分离鉴定无乳链球菌中的应用。

4.根据权利要求3所述的一种无乳链球菌快速分离鉴定试剂盒在分离鉴定无乳链球菌中的应用，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

1）细菌分离：将待检样品无菌接种于绵羊脱纤血平板上，划线进行细菌分离；

2）镜检：将步骤1）分离的细菌，置37℃温箱中培养18-20 h，将肉眼观察菌落为灰白色或毛玻璃色、湿润、隆起、边缘整齐的小的单个菌落挑取到营养肉汤管中，37℃温箱中培养18-20 h；将待鉴定的细菌菌液涂片，革兰氏染色，显微镜观察后，以革兰氏阳性、正圆或椭圆、成丛或成对、短链或长链排列的，初步判定为G⁺球菌属；

3）接触酶试验：将步骤2）得到的初步判定为G⁺球菌属的样品进行接触酶试验，以结果为阴性的，初步判定为链球菌属；

4）CAMP试验：将步骤3）中初步判定为链球菌属的样品进行CAMP试验，以CAMP试验结果为阴性判定为非无乳链球菌，以CAMP试验结果为阳性判定可进行下一步鉴定；

5）PCR检测：将步骤4）中，CAMP试验结果为阳性的菌株的肉汤培养物提取细菌DNA，加入特异性PCR反应液中进行特异性PCR扩增；PCR反应体系为特异性PCR反应液27μL，待检细菌DNA模板60-120ng，补充灭菌超纯水至终体积50μL；阳性对照的反应体系为：特异性PCR反应液27μL，阳性对照DNA 5μL，补充灭菌超纯水至终体积50μL；所述PCR的反应条件为：95℃预变性5min后进入循环，循环参数94℃ 1min，45℃1.5min，72℃1.5min，30个循环后，72℃延伸10min；反应结束后，取PCR产物10μL在10g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，以待检细菌样品为革兰氏阳性球菌、接触酶阴性、CAMP阳性和PCR扩增出特异性1270bp的目的片段进行判定为无乳链球菌。