[发明专利]钙离子结合位点氨基酸残基突变改善环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的方法

说明书

技术领域

具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及其方法，本发明属于基因工程和酶工程领域。具体的说本发明是利用定点突变技术改善环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性。 

背景技术

由于环糊精的环状中空圆锥形结构具有内疏水、外亲水的特性，能与多种疏水性物质形成包合物，因此，在医药、化工、食品、材料和分析化学等领域有着广泛应用，其中α-、β-和γ-环糊精最为常见。 

目前，环糊精通常由环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)作用淀粉而合成。CGT酶是一种多功能型酶，能催化环化反应、偶合反应、歧化反应和水解反应，其中环化反应是其工业应用的基础。已知野生CGT酶环化反应的产物均是α-、β-和γ-环糊精的混合物，不利于产物的分离纯化，增加了环糊精的生产成本，因此，有必要改善其产物特异性。研究发现，钙离子结合位点普遍存在于CGT酶中，且可能与CGT酶的产物特异性密切相关。 

本发明主要是将来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的CGT酶中钙离子结合位点处第315位氨基酸残基进行突变，以改善CGT酶的产物特异性。 

发明内容

本发明的目的是提供提高B.circulans STB01CGT酶产β-环糊精能力的突变方案。 

本发明的另一个目的是提出具有更高β-环糊精生产能力的突变体A315R和A315D及其构建方法。 

本发明的技术方案： 

来源于B.circulans STB01的CGT酶的突变体A315R和A315D，是将CGT酶中钙离子结合位点处第315位Ala分别突变为Arg和Asp。相比于野生CGT酶，突变体A315R和A315D具有更高的β-环糊精生产能力。 

所述的突变体A315R和A315D的制备方法，是根据B.circulans STB01CGT酶基因序列，分别设计相应突变位点的引物，对CGT酶基因进行突变，并且鉴 别出Ala315密码子已经变成Arg315、Asp315密码子的突变基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。 

(1)定点突变 

利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。 

引入Arg315密码子的突变引物为： 

正向引物：5’-GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3’，下划线为突变碱基， 

反向引物：5’-GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3’，下划线为突变碱基； 

引入Asp315密码子的突变引物为： 

正向引物：5’-GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3’，下划线为突变碱基。 

反向引物：5’-GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3’，下划线为突变碱基。 

PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。 

PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。 

将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。 

(2)突变体的表达与纯化