[发明专利]钙离子结合位点氨基酸残基突变改善环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的方法

权利要求书

1.来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)的突变体A315R和A315D，其特征是：将CGT酶中钙离子结合位点处第315位丙氨酸(Ala)分别突变为精氨酸(Arg)或天冬氨酸(Asp)；相比于野生CGT酶，突变体A315R和A315D具有更高的β-环糊精生产能力。

2.权利要求书1中所述突变体A315R和A315D的制备方法，其特征是根据B.circulans STB01CGT酶基因序列，分别设计相应突变位点的引物，对CGT酶基因进行突变，经测序验证后将突变基因转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。

3.权利要求书2中所述突变体A315R和A315D的制备：

(1)定点突变

利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。

引入Arg315密码子的突变引物为：

正向引物：5’-GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3’，下划线为突变碱基；

引入Asp315密码子的突变引物为：

正向引物：5’-GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3’，下划线为突变碱基。

反向引物：5’-GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3’，下划线为突变碱基。

PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。

PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。

将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。

(2)突变体A315R和A315D的表达

挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体A315R和A315D酶制品。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。