[发明专利]一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用

说明书

技术领域

一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，属于生物制品分离纯化、食品添加剂技术领域。

背景技术

对植物蛋白的开发利用，可从营养和功能特性两方面综合考虑，营养特性是基础，功能特性决定着蛋白质资源的真正利用价值。通过对植物蛋白进行加工开发其功能特性，是提高蛋白质价值的一种有效手段。利用酶解技术加工植物蛋白生产生物活性肽，可应用于食品、医药、保健品及化妆品等领域中。

豌豆作为一种传统的豆类作物，在我国拥有相当丰富的资源，存在着极大的开发潜能。国内目前对于豌豆的综合利用和深加工仍处于起步阶段，豌豆主要被许多厂家作为制作粉丝的原料，其主要是利用豌豆中的富淀粉含量来加工成粉丝，而剩下的膳食纤维和蛋白质等常用作饲料，这降低了豌豆的利用价值，因此需要提高豌豆功能特性方面的开发。豌豆蛋白的酶解产物中存在的生物活性肽，因其对人体具有多方面有益的生理功能，具有在食品加工、保健食品、医药等领域的开发潜力，可提高豌豆的利用率与使用价值，扩大豌豆的应用前景。

抗氧化剂是维持食品原有质量和人体抗氧化防御系统动态平衡的物质基础，因此获取抗氧化剂显得非常重要。化学合成和自然存在的物质都具有抗氧化能力，化学抗氧化剂一般具有较高的有效性和很好的经济效益，然而安全性得不到保证，具有一定的毒性，只能在一定范围内使用。来自食物中的天然抗氧化剂虽然一般不及人工合成的高效，可是天然抗氧化剂没有剂量的限制，当达到一定浓度时可与化学抗氧剂等效，天然抗氧化剂安全无毒，对人体不存在副作用，现在已成为研究开发的热点，越来越多的人们倾向于选择天然抗氧化剂。

存在于蛋白质中的一些多肽具有抗氧化能力，自从第一次报告提出以来，越来越多的国内外学者对其进行广泛的研究。抗氧化肽安全高效，容易被人体吸收、分子量小、结构简单，在不同环境下保持稳定，不存在免疫排斥反应，除抗氧化性外还可作为机体的营养物质。因此，可以确信在食品、医药、人类健康等领域，采用酶法制备抗氧化肽是开发天然、安全、营养的抗氧化剂的一个重要方向。

发明内容

本发明目的是一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到抗氧化多肽粗品即豌豆蛋白水解产物PPH。PPH经凝胶层析和反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，液质联用分析推测其氨基酸序列。对PPH进行放大制备工艺与应用探究，选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜进行脱盐浓缩处理，以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力，初步探明该豌豆抗氧化肽在功能型化妆品中的应用潜力。

本发明的技术方案：一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH即抗氧化肽粗品。该粗品PPH经Sephadex G-25凝胶层析和两次RESOURCE^TM 3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，步骤为：

A豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽

（1）原料预处理：以豌豆分离蛋白为原料，配置质量浓度为7.5%的豌豆分离蛋白水溶液，90℃水浴15 min 进行预处理，冷却备用；

（2）胰蛋白酶酶解：随后放在恒温磁力搅拌器上，溶液边搅拌边调至温度40℃、pH 10，按照酶底比E/S为6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活为4×10⁴ U/g，开始水解反应，随时滴加2 M NaOH溶液保持酶解液pH 10不变，充分酶解反应4 h后，煮沸15 min灭酶；

（3）中性蛋白酶酶解：步骤（2）产物冷却后按50℃、pH 7.5，E/S为6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活为1×10⁵ U/g，水解4 h，煮沸灭酶，冷却后用2 M HCl溶液调pH 7；

（4）离心：步骤（3）产物按照8000 r/min离心15 min去沉淀，所得上清液为豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；

B 酶解豌豆抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法

（5）对PPH冻干样选用Sephadex G-25进行分离，规格为1.6 cm×60 cm，配置浓度50 mg/mL，加样量为2 mL，以纯水为洗脱剂，流速为1.5 mL/min，在280 nm处检测吸光度，在相同浓度下检测各峰DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥；