[发明专利]一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用

权利要求书

1.一种豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；该粗品PPH经Sephadex G-25凝胶层析和两次RESOURCE^TM 3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，步骤为：

A豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽

（1）原料预处理：以豌豆分离蛋白为原料，配置质量浓度为7.5%的豌豆分离蛋白水溶液，90℃水浴15 min进行预处理，冷却备用；

（2）胰蛋白酶酶解：随后放在恒温磁力搅拌器上，溶液边搅拌边调至温度40℃、pH 10，按照酶底比E/S为6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活为4×10⁴ U/g，开始水解反应，随时滴加2 M NaOH溶液保持酶解液pH 10不变，充分酶解反应4 h后，煮沸15 min灭酶；

（3）中性蛋白酶酶解：步骤（2）产物冷却后按50℃、pH 7.5，E/S为6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活为1×10⁵ U/g，水解4 h，煮沸灭酶，冷却后用2 M HCl溶液调pH 7；

（4）离心：步骤（3）产物按照8000 r/min离心15 min去沉淀，所得上清液为豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；

B 酶解豌豆抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法

（5）对PPH冻干样选用Sephadex G-25进行分离，规格为1.6 cm×60 cm，配置浓度50 mg/mL，加样量为2 mL，以纯水为洗脱剂，流速为1.5 mL/min，在280 nm处检测吸光度，在相同浓度下检测各峰DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥；

（6）选出抗氧化性高的一组分在AKTA蛋白质分析纯化仪上进行反相色谱纯化，样品溶解于含有0.05% (v/v) 三氟乙酸TFA的水溶液中，选用RESOURCE^TM 3RPC色谱柱，进样量为1 mL，以2 mL/min的流速用含5%乙腈和0.05%TFA的水溶液A进行洗脱，检测波长为215 nm，使用自动收集器收集洗脱峰；5 min后，以流速为3 mL/min进行梯度洗脱，20 min时达到100%溶液B，溶液B 为含60%乙腈和0.05%TFA的水溶液，每管5 mL进行收集；富集的样品进行旋转蒸发、冷冻干燥后测各组分的DPPH清除能力；

（7） 选出DPPH清除率高的组分再一次进行反相层析，溶液C为：含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D为：含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他条件保持不变；按峰收集样品，旋转蒸发、冷冻干燥成粉末，检测各峰的DPPH清除能力，选出活性最高的峰进行冷冻干燥；当浓度在0.2 mg /mL时，对DPPH的清除率达到62.03%，接近于同浓度下生物体内存在的抗氧化肽GSH对DPPH的清除能力66.42%，有很强的抗氧化性；

（8）利用RP-HPLC分析型色谱测定纯化后的豌豆抗氧化肽样品，在9.436 min时出现一个比较纯的洗脱峰，纯度达到90.12%；经液质联用分析推测出相对分子量为956.5 Da，氨基酸序列为Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu。

2.权利要求1所述方法制备的抗氧化肽的应用，其特征在于对所得PPH选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜对PPH粗品进行脱盐浓缩处理，脱盐率达到79.87%，PPH浓缩2.86倍，纳滤过后蛋白损失率为12.15%；随后以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力；

（1）纳滤脱盐：豌豆蛋白双酶酶解生成豌豆蛋白水解产物PPH选用PES 10000超滤膜，在操作压力为0.2 MPa下进行除沉淀和大分子物质；分子量＜10 KDa透过液进行PES 500纳滤脱盐，测定Cl^-离子浓度和根据双缩脲法测定多肽浓度，在室温，操作压力为0.5 MPa条件下，进行预浓缩，期间测定Cl^-离子浓度，计算脱盐率；随后加入纯水，继续进行除盐，如此反复操作三次；

最终脱盐率可达到79.87%，PPH浓缩了2.86倍；测定抗氧化肽浓度，由纳滤前的8.57 mg/mL变为浓缩后的21.51 mg/mL，纳滤过后蛋白损失率为12.15%；对纳滤前后的样品在不同浓度下进行DPPH清除能力的测定并计算IC₅₀值，纳滤后的样品IC₅₀值为2.53 mg/mL，而纳滤前为2.89 mg/mL，PPH经过纳滤脱盐处理对DPPH清除能力没有下降；

（2）用于制作润肤霜：将纳滤脱盐后的样品进行冷冻干燥用于润肤霜的制作，按0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的添加量分别加入到水相中，再与油相混合，即得抗氧化肽润肤霜；观察到分别在-18℃和48℃下放置24 h后恢复至室温无分层情况；在3000 r/min条件下离心30 min无分层情况；感官观察显示不同浓度的润肤霜结构细腻，无气味；除当添加量达到0.7%时润肤霜显浅黄色外，其余色泽白皙；表明在润肤霜制作过程中加入不同浓度的豌豆抗氧化肽状态仍保持稳定，不改变润肤霜的性质；

（3）进行DPPH清除率测定：将不同浓度的润肤霜放置一周后用C₂H₅OH︰CHCl₃体积比1︰1的混合溶剂溶解，进行DPPH清除率测定，将溶解样于太阳光下照射2小时后再进行抗氧化能力测定，反应完成后在5000 r/min下离心5 min后测定吸光度，与PPH原液进行比较发现，制备的豌豆抗氧化润肤霜放置一周后依然能检测出具有抗氧化能力，与豌豆抗氧化肽原样相比，对DPPH自由基清除能力基本保持不变，DPPH清除率随着抗氧化肽添加量的增大而增加，光照处理后的样品对DPPH清除率有所降低，但仍能保持原有的80%，豌豆抗氧化肽的抗氧化性在润肤霜中以及对光照具有很好的稳定性。