[发明专利]一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术领域，特别涉及一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，结核菌可侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，成为肺结核病。根据世界卫生组织2009年的报告，目前全球有三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新增病人超过900万，其中42万为多耐药结核，死亡200万，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度居全球第二位，我国结核病耐药情况严重，耐药率高达27.8%，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战，异烟肼（isoniazid，INH）是20世纪50年代开始用于临床的酰肼类化学合成药，是结核病合并治疗的一线核心药物，也是结核分枝杆菌隐性感染的首选药物。到目前为止，较多文献报道它是一种前体药物，在菌体内被katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶激活，作用于细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系而干扰分枝菌酸的生物合成，最终导致菌体细胞壁损伤而死亡，异烟肼耐药相关突变主要发生在KatG315位点，inhA94位点，inhA启动子区和ahpC启动子区（除-46位点）。

现有的检测结核病的方法主要为基因检测，由于结核菌耐药的产生主要是基因组DNA中抗结核药物作用靶基因突变所致，因此基因检测更为直接，基因检测法的基本过程为先扩增耐药相关基因，然后分析扩增产物，结核耐药位点分散、突变类型多样，针对该特点，近年来出现了如液相芯片法、MLPA（Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification，多重连结依赖探针扩增）以及焦磷酸测序等高通量筛查技术应用于结核耐药突变分析的报道。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

对于液相芯片法、MLPA技术以及焦磷酸测序等高通量筛查技术应用于结核耐药突变，这些方法虽然检出率高，但是成本也高，而且PCR后处理步骤复杂，增加了产物污染的几率，提高了对实验室及人员的要求。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明实施例提供了一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法。所述技术方案如下：

一方面，一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，包括检测用引物和荧光探针，所述检测用引物和荧光探针包括katG基因的正向引物、katG基因的野生型正向引物、katG基因的第一突变型正向引物、katG基因的第二突变型正向引物、katG基因的反向引物、katG基因的荧光探针、inhA基因的正向引物、inhA基因的野生型正向引物、inhA基因的突变型正向引物、inhA基因的反向引物和inhA基因的荧光探针，具体序列为：

所述katG基因的正向引物katG-F如序列表中SEQ ID NO:1所示；

所述katG基因的野生型正向引物katG-Fw如序列表中SEQ ID NO:2所示；

所述katG基因的第一突变型正向引物katG-Fm-1如序列表中SEQ ID NO:3所示；

所述katG基因的第二突变型正向引物katG-Fm-2如序列表中SEQ ID NO:4所示；

所述katG基因的反向引物katG-R如序列表中SEQ ID NO:5所示；

所述katG基因的荧光探针katG-P如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述inhA基因的正向引物inhA-F如序列表中SEQ ID NO:7所示；

所述inhA基因的野生型正向引物inhA-Fw如序列表中SEQ ID NO:8所示；

所述inhA基因的突变型正向引物inhA-Fm如序列表中SEQ ID NO:9所示；

所述inhA基因的反向引物inhA-R如序列表中SEQ ID NO:10所示；

所述inhA基因的荧光探针inhA-P如序列表中SEQ ID NO:11所示。

可选地，所述荧光探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour，所述荧光探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL。