[发明专利]一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，其特征在于，包括检测用引物和荧光探针，所述检测用引物和荧光探针包括katG基因的正向引物、katG基因的野生型正向引物、katG基因的第一突变型正向引物、katG基因的第二突变型正向引物、katG基因的反向引物、katG基因的荧光探针、inhA基因的正向引物、inhA基因的野生型正向引物、inhA基因的突变型正向引物、inhA基因的反向引物和inhA基因的荧光探针，具体序列为：

所述katG基因的正向引物katG-F如序列表中SEQ ID NO:1所示；

所述katG基因的野生型正向引物katG-Fw如序列表中SEQ ID NO:2所示；

所述katG基因的第一突变型正向引物katG-Fm-1如序列表中SEQ ID NO:3所示；

所述katG基因的第二突变型正向引物katG-Fm-2如序列表中SEQ ID NO:4所示；

所述katG基因的反向引物katG-R如序列表中SEQ ID NO:5所示；

所述katG基因的荧光探针katG-P如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述inhA基因的正向引物inhA-F如序列表中SEQ ID NO:7所示；

所述inhA基因的野生型正向引物inhA-Fw如序列表中SEQ ID NO:8所示；

所述inhA基因的突变型正向引物inhA-Fm如序列表中SEQ ID NO:9所示；

所述inhA基因的反向引物inhA-R如序列表中SEQ ID NO:10所示；

所述inhA基因的荧光探针inhA-P如序列表中SEQ ID NO:11所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour，所述荧光探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL。

3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的5’端均连接有所述荧光基团FAM，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的3’端均连接有所述淬灭基团BHQ1。

4.一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有权利要求1-3任一项所述检测用引物和所述荧光探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸提取反应液、PCR反应液和对照试剂；所述核酸提取反应液为TB DNA提取液；所述PCR反应液包括TB酶和INH PCR Mix A；所述对照试剂包括INH阳性对照和TB阴性对照。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述INH阳性对照为INH野生型质粒；所述TB阴性对照为质量分数为0.09%的生理盐水；所述TB DNA提取液包括1mM乙二胺四乙酸二钠、10mMTris和10%Triton-100。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述INH PCR Mix A包括1×PCR Buffer、3.5mM MgCl₂、0.8mM dNTPs、0.4μM dUTP、0.8μM所述katG基因的正向引物、0.8μM所述katG基因的野生型正向引物、0.8μM所述katG基因的第一突变型正向引物、0.8μM所述katG基因的第二突变型正向引物、0.8μM所述katG基因的反向引物、0.2μM所述katG基因的荧光探针、0.8μM所述inhA基因的正向引物、0.8μM所述inhA基因的野生型正向引物、0.8μM所述inhA基因的突变型正向引物、0.8μM所述inhA基因的反向引物和0.2μM所述inhA基因的荧光探针。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述TB酶包括2.5U Taq酶和0.5U UNG酶。