[发明专利]一种基因点突变的实时PCR检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因点突变的检测方法。 

背景技术

随着人类基因图谱草图的公布和各种病原体基因序列的揭示，这都将极大的促进疾病相关基因的结构和功能研究，特别是基因缺失、错位、突变(有义突变)等与疾病的关系。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。PCR扩增技术问世以来，建立于扩增基础上的突变检测技术使检测靶DNA(目的DNA)含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足等难题得以克服，使得分子诊断技术进入了新阶段。 

在过去十多年中，曾出现了多种点突变的检测方法。 

1.经典的PCR-RFLP等点突变的检测方法。RFLP连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法，其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1％才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。 

2.反向限制性位点突变分析(iRSM)：在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量(一般消化率＞99％)，因而大大 提高了突变序列的检出率。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。 

3.基因芯片具有检测信息高通量和自动化程度高，一次性检测可检出多个位点突变，具有很大的发展潜力，但制备技术要求高。 

4.DNA测序 

Sanger DNA测序是点突变检测的金标准。但Sanger测序灵敏度低，测序准备时间长。另一个方法是焦磷酸测序，它的特点是准备时间短，测序也快。但是这两种方法都需要对PCR产物处理，需要非常小心地防止产物污染。 

5.等位基因特异性扩增 

一个引物的3’端与特定的突变碱基相配，特异性扩增这一突变的片断，灵敏度高，但一个反应只能检测一个突变。比如Therascreen KRAS RGQ PCR Kit，每个样品做8个PCR反应，也只能检测7个常见的突变，而KRAS在密码子12，13上可能的突变是12个。 

6.等位基因区别实时PCR 

在PCR反应中有两个特异的探针，区别野生型和突变型，灵敏度和特异性都低于特异性扩增，也是一个反应测定一个突变。 

7.荧光PCR检测点突变 

SYBR Green I结合熔解曲线分析点突变简单、快速、自动化程度较高，易于推广；但是所用的染料SYBY Green I与溴乙啶、YO-PRO-1^[一样，缺乏序列特异性，因此不可避免的将会降低其敏感性。在扩增过程中产生的非特异性荧光，通常是由引物二聚体和其它污染物的扩增产物引起的，单以荧光很 难将其与靶序列发出的荧光相区分。另外扩增产物碱基序列数较大时，单个碱基置换引起的点突变其Tm变化较小，运用SYBR Green I和熔解曲线分析就很难检出。 

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)结合探针熔解曲线分析点突变。通过对杂交产物稳定性进行实时监测，并结合熔解曲线分析，提高了对点突变检测的分辨率 

SYBR Green I法和FRET法对点突变的检测均依赖于熔解曲线分析，但存在着诸多限制条件，即：①熔解曲线的相对位置和宽度与所加入的染料浓度及温度转换率相关。 

在分子生物学基因点突变的研究中，仍需加强研究，克服上述各方法的不足。 

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简单、成本低，无PCR产物污染的风险，适用于大批量样品的检测，可以精确定位突变位点，所需的DNA样品量少的基因点突变检测方法。 

为实现上述放目的，本发明采用如下技术方案： 

一种基因点突变的实时PCR检测方法，包括以下步骤(1)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变。