[发明专利]一种基因点突变的实时PCR检测方法及其应用

权利要求书

1.一种基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变。

2.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(1)所述的DNA扩增循环使用由上游探针和下游探针组成的双探针，所述上游探针的尾端接一个Fluorescein，所述下游探针的头端标记一LC荧光色团，双探針之一覆盖突变点，突变点和双杂交探针在引物的下游尽量靠近另一个引物。

3.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(1)所述的DNA扩增循环包括：1)聚合酶被激活、样品DNA变性双链分开成两条单链。2)接着温度下降至使DNA退火，3)引物联合在样品DNA单链上形成双链，聚合酶以样品DNA为模板开始合成，同时双杂交探针也在其中一条样品单链上；4)上游探针的尾端和下游探针头端靠近，发生荧光共振能量传递，5)然后温度升至72℃左右，在这个温度下，杂交探针已变性离开杂交位置，聚合酶快速合成DNA形成两条双链，6)温度又上升至90-95℃，扩增开始第二轮循环。

4.根据权利要求3所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，1)所述的聚合酶被激活是在95℃高温10分钟，所述DNA退火温度，52～58℃。

5.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(2)所述的解链曲线分析程序包括升高温度变性扩增的DNA，降低温度让探针与单链DNA杂交，然后缓慢升高温度让探针与扩增的DNA片断变行解链。

6.根据权利要求5所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，变性扩增的DNA温度为95℃，退火让探针与单链DNA杂交的温度为40℃，所述让探针与扩增的DNA片断变性解链的温度由荧光(F)和温度(T)的负导数(-dF/dT)确定。

7.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(3)所述判定所测基因有无突变是根据探针解链的温度来判定：如果有突变用解链曲线分析，突变型基因的解链温度会发生左移，比野生型低3℃，杂合基因有两个解链温度峰；无突变，解链温度不发生左移，有一个解链温度峰。

8.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，扩增片断要大于150bps，福尔马林固定石蜡包埋的组织约200bps，血液或新鲜组织可以大至300bps。

9.权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法在基因点突变检测中的应用，其特征在于，应用域临床疾病的分子诊断。