[发明专利]发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法

说明书

技术领域

本发明涉及碱性蛋白酶高产菌株的诱变选育及利用该菌株发酵制备碱性蛋白酶的方法，涉及微生物领域。 

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline Protease)是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类，其最适pH值一般为9～11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类。碱性蛋白酶除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成。 

碱性蛋白酶最早在猪的胰脏中发现。1913年，Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年，瑞士的Dr.Jaag等发现了微生物碱性蛋白酶(Pose A H，1980)，使蛋白酶有可能广泛应用于洗涤剂工业。1963年，诺和诺德公司(现诺维信公司)发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶Alcalase，酶制剂被广泛地皮用于洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉，随后的20年中，细菌类蛋白酶是唯一被应用于洗涤剂的商品化酶制剂。 

碱性蛋白酶主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量的60％，其中碱性蛋白酶就占37％。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竟相对其进行多方面的研究。 

碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究最为广泛和深入。目前用于碱性蛋白酶工业化生产的菌种主要有：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌等。我国用于生产碱性蛋白酶的菌种主要有：地衣芽孢杆菌2709、短小芽孢杆菌289和209菌 株(方海红等，2002)、嗜碱性短小芽孢杆菌B45等。 

国内50年代开始选育产碱性蛋白酶菌株，60年代末上海洗涤剂厂选育出地衣芽孢杆菌2709，70年代中国科学院林业±壤研究所选育出短小芽孢杆菌289和290。我国目前用于碱性蛋白酶的生产菌和研究对象主要是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及短小芽孢杆菌，如2709地衣芽孢杆菌和1213地衣芽孢杆菌，嗜碱性短小芽孢杆菌B45等。我国自1978年开始推广应用，目前加酶洗涤剂约占总洗涤剂的10％～15％，1989年生产洗涤剂用蛋白酶15-20万吨，目前生产应用更多。近年来我国科学工作者对碱性蛋白酶生产进行了不懈的探讨。邱秀宝等人1980年对工业用短小芽孢杆菌209产的碱性蛋白酶进行了部分纯化，并对酶的性质和应用进行了研究。1988年又从土样中筛选到一株嗜碱性短小芽孢杆菌R115，经选育获得一株高产、稳产碱性蛋白酶变异株B45。郑铁曾等(1993)进行了提高C1213菌碱性蛋白酶活力的研究，酶活力提高了170％。薛林贵，冯清平等(1997)从28份土样中筛选到一株嗜碱性地衣芽孢菌株，对其原生质体进行复合及诱变处理，从中选育出了耐高温，耐碱的碱性蛋白酶高产菌株，以期应用于工业生产。 

与国内相比，国外在碱性强白酶的菌株选育以及应用方面远远领先于国内，关于菌株的筛选及其应用性质的报道层出不穷，并且许多已进行了商业化生产。 

peepti Agrawal等报道(2005)了从土壤中筛选到一株碱性蛋白酶产生菌Aspergillus oryzae NCIM649，该菌所产碱性蛋白酶可以运用于大豆蛋白的水解。S.Mehrotra，P.K等(1999)报道从盐碱性土壤中筛选到一株芽孢杆菌，该菌可以以无机氮氯化铵为唯一氮源产碱性蛋白酶。B.Johnvesly(2001)筛选到一株嗜热、嗜碱性芽孢杆菌JB-99，该菌株所产碱性蛋白酶最适温度为80℃，80℃加热1h，仍保持78％的活性。Ruchi Oberoi(2001)筛选到一种SDS稳定型碱性蛋白酶，酶的作用温度范围在20-80℃，0.1％SDS作用1h，酶活没有改变，0.5％SDS作用1h，活 性保持70％。该酶对各种表面活性剂、氧化剂均有良好的抗性，是一种较为理想的洗涤用酶。Rathindra Monhan Banik(2004)筛选到了一株产碱性蛋白酶的蜡样芽胞杆菌，该酶最适温度为50℃，最适pH10.5-11.0，40℃保温1h，残余酶活70％，50℃保温1h，残余酶活30％左右，也可作为商业用洗涤剂添加物开发。 

我国碱性蛋白酶的研究发展很快，随着重组DNA技术的发展，蛋白酶的蛋白质工程研究也开展并取得了一定的成果。虽然我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平不断提高，但我国在碱性蛋白酶出发菌种的筛选方面的工作还是很不够的，并且碱性蛋白酶的酶学性质仍不能满足实际应用领域的要求，特别是在食品应用领域，大多数采用进口碱性蛋白酶制剂，并且大规模工业用碱性蛋白酶也主要依赖进口。