[发明专利]发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法

权利要求书

1.发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法，主要包括以下步骤：

1)高产菌株筛选：将复筛选出的嗜碱性芽孢杆菌SVF176菌株接入固体斜面培养基中培养，制成菌悬液。紫外线-NTG复合诱变，酪蛋白平板分离培养，筛选出碱性蛋白酶高产菌株Svf4-21-7(CGMCC No.6417)。

2)发酵罐发酵：菌种经种子逐级扩大培养，转入发酵罐发酵。

3)提取纯化：发酵液预处理后，经硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩、凝胶过滤层析后冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末。

2.根据权利要求1所述的紫外线-NTG复合诱变方法，其特征在于：紫外线诱变时间为20～90s，NTG终浓度为40～400g/ml。

3.根据权利要求1所述的发酵培养基成分，其特征在于：棉籽饼粉(60～100目)1～5％，酵母浸粉0.50～2.00％，麦芽糊精(DE＝30％)5～15％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2.0％。

4.根据权利要求1所述的发酵条件，其特征在于：装料系数0.50～0.80，温度30～37℃，转速200～800r/min，通风量1∶0.5～1∶2.5，溶氧维持在30～40％。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩、凝胶过滤层析逐步纯化。

6.根据权利要求1所述的硫酸铵盐析方法，其特征在于：硫酸铵饱和度为30％～80％，沉淀添加Tris-HCl-CaCl₂的浓度为10～25mmol/L。

7.根据权利要求1所述的离子交换层析方法，其特征在于：采用DEAE-sepharose Fast Flow装柱，用basic buffer平衡2～4个柱体积，上样结束，用basic buffer洗脱2～5个柱体积，改用1％～5％KCl浓度的elution buffer分段洗脱，洗脱速度0.4～1.0mL/min。

8.根据权利要求1所述的聚乙二醇包埋浓缩方法，其特征在于：采用的聚乙二醇为PGE6000～20000。

9.根据权利要求1所述的凝胶过滤层析方法，其特征在于：采用Sephacryl S-300 HR装柱，用1～3倍柱床体积的buffer洗涤层析柱；洗脱缓冲液进行蛋白洗脱，洗脱速度为0.4～1.0mL/min。