[发明专利]产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

四环素类抗生素是抑制细菌蛋白合成的一大类广谱抗生素，对多种革兰阳性和阴性菌、立克次体属、支原体属和螺旋体等均有效。包括第一代四环素类抗生素四环素、金霉素和土霉素，它们分别由主要产金霉素（chlortetracycline）的金黄色链霉菌（Streptomyces aureofacines）和产土霉素（oxytetracycline）的龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）发酵产生。20世纪70年代开始应用半合成技术对四环素和土霉素进行了化学修饰，得到了第二代四环素类抗生素如7-氯代-6-去甲四环素、强力霉素和以土霉素为母核的二甲胺四环素，这些改进药性的半合成衍生物推动了四环素类抗生素的发展。2005年美国食品药品管理局（FDA）批准替加环素上市，以此为代表的甘氨酰环素类抗生素的上市标志着第三代四环素的诞生。其中第一代四环素类抗生素四环素、金霉素和土霉素因广谱、使用方便、经济等特点广泛应用于医药、畜牧和水产业，全球市场需求巨大。目前，工业生产上用产生金霉素的金黄色链霉菌来生产四环素，向培养基中添加一定浓度的溴化钾，抑制金霉素的产生而生产四环素。这种添加溴化钾发酵生产四环素的方法，不仅增加了工艺流程和生产成本，而且带来了严重的污染问题。

近年来随着分子遗传学和化学生物学研究的深入，可以利用代谢工程（metabolic engineering），特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径获得基因重组菌株，从而直接发酵产生所需要的抗生素及其类似物（Keasling JD.Manufacturing molecules through metabolic engineering.Science.2010,330:1355-1358.）。与化学合成相比，目的代谢产物可以由获得的重组菌株发酵大量生产，因而可以降低生产成本和减少环境污染。由于金黄色链霉菌遗传操作困难，对四环素类抗生素的生物合成的研究只能局限于随机突变株，所以大大限制了四环素类生物合成研究以及利用代谢工程特异性地进行遗传改造方面的工作。

经对现有技术文献检索，未发现通过敲除氯代反应相关基因改变菌种次级代谢物组份和产量的相关技术报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法。本发明的方法种将氯代反应相关基因进行了基因敲除，从而获得发酵时只产生四环素的菌种的方法，采用这样的菌种发酵不仅四环素产量高，而且在发酵过程中不用添加溴化钾作为抑制剂，节约了生产成本，简化了工艺流程，避免了工业污染。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：

对金霉素产生菌中参与金霉素合成氯化相关基因进行了基因中断，进而得到只产生四环素的基因工程菌株。

优选地，所述金霉素产生菌为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3CCTCCNO：M2013080。

优选地，所述参与金霉素合成氯化相关基因为氯化酶ctcP基因。

优选地，所述方法包括如下步骤：

步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶基因ctcP中断的同源交换质粒；

步骤二，将所述同源交换质粒转入金色链霉菌中，进行DNA同源重组，进而得到产生四环素单一组分的基因工程菌株。

优选地，步骤一中，所述同源交换质粒为ctcP突变的柯斯质粒pJTU4301。

优选地，步骤一中，所述转入包括如下步骤：将构建的同源交换质粒通过大肠杆菌与金色链霉菌双亲之间进行的的接合转移，进而将同源交换质粒转入金色链霉菌。

优选地，所述大肠杆菌为E.coli ET12567，其携带质粒pUZ8002。

优选地，所述构建方法包括如下步骤：

步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶ctcP基因中断的同源交换质粒；

利用CopyControl^TMFosmid Library Production试剂盒构建Streptomyces aureofaciens F3基因组文库，根据卤化酶基因设计探针确定柯斯质粒11D1包含完整CTC合成基因簇，将柯斯质粒11D1，通过λ-Red介导的大肠杆菌基因重组，将氯化酶基因ctcP突变掉，得到质粒pJTU4301；