[发明专利]产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法

权利要求书

1.一种产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：对金霉素产生菌中参与金霉素合成氯化相关基因进行了基因中断，进而得到只产生四环素的基因工程菌株。

2.如权利要求1所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述金霉素产生菌为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3CCTCC NO：M2013080。

3.如权利要求2所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述参与金霉素合成氯化相关基因为氯化酶ctcP基因。

4.如权利要求3所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述方法包括如下步骤：

步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶ctcP基因中断的同源交换质粒；

步骤二，将所述同源交换质粒转入金色链霉菌中，进行DNA同源重组，进而得到产生四环素单一组分的基因工程菌株。

5.如权利要求4所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，步骤一中，所述同源交换质粒为ctcP突变的柯斯质粒pJTU4301。

6.如权利要求4所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，步骤一中，所述转入包括如下步骤：将构建的同源交换质粒通过大肠杆菌与金色链霉菌双亲之间进行的的接合转移，进而将同源交换质粒转入金色链霉菌。

7.如权利要求6所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述大肠杆菌为E.coli ET12567，其携带质粒pUZ8002。

8.如权利要求6所述的产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法，其特征是，所述构建方法包括如下步骤：

步骤一，采用壮观霉素抗性基因构建氯化酶ctcP基因中断的同源交换质粒；

利用CopyControl^TMFosmid Library Production试剂盒构建Streptomyces aureofaciens F3基因组文库，根据卤化酶基因设计探针确定柯斯质粒11D1包含完整CTC合成基因簇，将柯斯质粒11D1，通过λ-Red介导的大肠杆菌基因重组，将氯化酶基因ctcP突变掉，得到质粒pJTU4301；

用EcoRI/HindIII将质粒pIJ778双酶切，回收包含oriT+addA的1.5kb片段，该片段转化大肠杆菌DH10B，在壮观霉素抗性平板上长不出单菌落，则为合格；

将回收的片段作为模板，用引物targPF/targPR扩增，回收1.5kb的PCR产物；

通过电转化将11D1导入E.coli BW25113感受态细胞，并制备E.coli BW25113/11D1电转化感受态细胞，将1.5kb片段用电转化导入其中，通过PCR引物对上39bp与ctcP基因外侧的同源片段与11D1重组，双交换之后的柯斯质粒pJTU4301包含ctcP突变的CTC合成基因簇；

步骤二，将所述同源交换质粒转入金色链霉菌中，进行DNA同源重组，进而得到产生四环素单一组分的基因工程菌株；

将柯斯质粒pJTU4301通过大肠杆菌与链霉菌双亲之间的接合转移，将所构建的质粒转入金色链霉菌；

ctcP突变的柯斯质粒pJTU4301必须在辅助质粒pUZ8002的协助下才能通过接合转移导入到受体金黄色链霉菌细胞中；

pJTU4301首先转化E.coli ET12567，在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，按照1/10接种量转接培养2小时，收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用；作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理；

将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液中，在50℃水浴中热激10min，冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基，37℃摇床培养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按10⁸:10⁸与大肠杆菌细胞等量混合后涂在培养平板上，进行细菌双亲接合转移；

16小时后用含萘啶酮酸和壮观霉素的1ml无菌水覆盖平板，置30℃培养7～10天后即可看到转移接合子；最终得到只产生四环素的基因工程菌株。