[发明专利]荧光PCR技术检测PDS基因IVS7-2A>G突变的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种探针特异性的实时PCR技术检测耳聋基因PDS IVS7-2A＞G突变的方法及其试剂盒。 

背景技术

耳聋是造成语言交流障碍最常见的疾病，新生儿耳聋的发病率为0.1％～0.3％。我国听力语言残疾者甚众，并以每年新生3万聋儿的速度增长，我国累计约有30万对生育至少一个聋儿的育龄夫妇面临再次生育的选择。耳聋发生的原因、是否具有遗传性、下一次生育是否安全是耳聋家庭极为关心的问题。大前庭水管综合征(Enlarge vestibular aqueduct syndrome.EVAS)是一种发病率较高的常染色体隐性遗传性听力障碍性疾病。影像学检查资料表明在儿童感音神经性聋患者中，大前庭水管是最常见的一种内耳畸形，在遗传性聋人群中发病率约为1％～1.3％，在某些地区甚至可达7％。SLC26A4基因定位于7q31，其mRNA全长4930bp，共有21个外显子.开放阅读框架2343bp，贯穿于外显子2和外显子21，编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，属于离子转运体家族，研究表明其功能主要与碘氯离子转运有关突变的特点。在EVAS患者中最常见的SLC26A4基因突变是IVS7-2A＞G。对中国人群进行IVS7-2A＞G突变的普遍筛查，可降低大前庭水管患儿的出生率。 

目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为PCR产物直接测序法。PCR产物直接测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性(RFLP)检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。公开的专利(专利号200610058282.6)依据PDS基因IVS7-2突变位点A＞G，设计了能包括该位点在内的上下游1-13个碱基范围内引入任意一个碱基替换突变的引物对，从而在扩增产物中能获得可鉴别A＞G位点的新的限制性内切酶位点，该方法需要后续酶切及电泳等过程，不适合临床推广。专利201010599385.X，采用特异性引物及探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术进行突变检测，该方法操作上复杂，仪器昂贵，也不易普及推广。 

本方法采用一种实时荧光聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测PDS基因IVS7-2A＞G突变的方法，针对PDS基因IVS7-2A＞G位点设计特异性野生型探针及突变型探针，野生型及突变型 探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在PDS基因IVS7-2位点两侧翼序列区设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。该方法具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单，检测单个位点突变需要1个PCR反应管实现的优点。适合临床实验室使用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种PDS基因IVS7-2A＞G突变的实时荧光PCR检测方法和试剂盒，可用于临床样本的检测。 

本发明的具体技术路线为： 

1)PDS基因外显子7-8区域(SEQ ID NO：5)的第7个内含子倒数第2个碱基(IVS7-2A＞G)位点处设计野生型探针及突变型探针，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序列。两种探针均覆盖PDS基因IVS7-2位点，其中野生型探针(SEQ ID NO：3)针对PDS基因IVS7-2野生型位点，突变型探针(SEQ ID NO：4)针对PDS基因IVS7-2突变位点。 

2)探针5’端标记荧光发生基团FAM或HEX等类似发光基团，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA或BHQ1等类似淬灭基团。探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可以是覆盖PDS基因IVS7-2位点的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5’端标记的荧光发生基团及其相应的3’端荧光淬灭基团可以是目前本领域中任何可用的荧光基团，如FAM，HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC，JOE，CY5等。可以使用目前常用的Taqman探针，也可以是在普通Taqman探针基础上经过修饰的LNA-Taqman探针，MGB-Taqman探针或现有技术能够实现的在Taqman探针基础上改良修饰的相关探针。