[发明专利]一种三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法。

背景技术

三角帆蚌是我国最主要的优质淡水育珠蚌，具有重要经济价值。育珠蚌的外套膜能分泌物质形成贝壳，还能分泌珍珠质形成珍珠。淡水蚌的蚌壳通常可分为角质层、棱柱层和珍珠层三层结构，贝壳不同的多层构造成因，通常认为是由外套膜外表皮细胞的类型不同造成的，即角质层由外套膜的生壳突起分泌形成，棱柱层由外套膜边缘膜的高柱状细胞分泌形成，珍珠层由外套膜中央膜的柱状细胞分泌形成。而对外套膜组织的切片制备尤其是制备能够包含外套膜所有细胞类型的组织切片，对于了解外套膜在贝壳和珍珠形成过程中的分泌机制具有重要意义。

由于三角帆蚌属于双壳类无脊椎动物，外套膜包被于贝壳里面，通常不易于观察和操作，因此单纯的体视显微镜观察或结合显微操作技术并不能很好的观察到外套膜的细微结构特征，利用组织切片技术则可以很好地解决这一问题。但是传统的组织切片技术动辄需要耗时数天时间，操作复杂，而且制备的组织切片常容易发生组织破碎、不连续的现象。

中国专利文献CN200410050434.9，申请日2004年9月17日，公开了一种海水鲆鲽鱼类受精卵的组织切片方法，包括材料固定、材料预处理、琼脂定位包埋、透明处理、透蜡处理、石蜡包埋和进行组织切片步骤，适用于海水鱼类卵的组织切片。中国专利文献CN201010585906.6，申请日2010年12月13日，公开了一种鱼类组织快速切片方法，包括鱼组织固定、切片、贴片、染色和封片等步骤，可以有效解决冰冻切片的组织、细胞的溶解、显微镜下图像模糊的问题。但是关于本发明三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法。该制备方法可以保证三角帆蚌外套膜各层组织和细胞结构完整，位置相对固定，并且简单、高效，适用于外套膜组织切片的快速大规模制备。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法，包括以下步骤：

（1）将三角帆蚌外套膜组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中进行固定；

（2）将固定好的外套膜组织用1×PBS冲洗后，经上行梯度乙醇脱水，然后经透明、浸蜡、包埋、连续切片得到切片，再贴片于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，40℃恒温箱烤片过夜，备染；

（3）烤好的切片用二甲苯脱蜡两次，每次均是脱蜡10 min，然后进行下行梯度乙醇复水，并用蒸馏水浸泡2 min；

（4）将复水后的切片放入苏木精中染色20～30 min，用自来水冲洗20 min后，放入1%（体积百分含量）盐酸乙醇溶液中分化褪色3 s；

（5）将步骤（4）中得到的切片再放入自来水流水中漂洗20 min，然后分别经过乙醇脱水Ⅰ、0.5%（质量百分含量）伊红乙醇溶液复染1 min、乙醇脱水Ⅱ；

（6）将步骤（5）中得到的切片用二甲苯透明两次，每次均是透明5 min，最后用中性树脂封片。

所述的三角帆蚌外套膜组织是指沿外套膜边缘向壳顶方向取得的宽0.5 cm、长1 cm的组织。

步骤（1）中所述的组织固定条件为温度4℃下固定过夜。

步骤（2）中所述的浸蜡操作所用的石蜡是指熔点为56～58℃的鳞片状切片石蜡。

步骤（2）中所述的上行梯度乙醇脱水具体步骤为：50%乙醇脱水45 min、70%乙醇脱水45 min、80%乙醇脱水45 min、90%乙醇脱水30 min、95%乙醇脱水30 min、第一次无水乙醇脱水30 min和第二次无水乙醇脱水30 min。

步骤（3）中所述的下行梯度乙醇复水具体步骤为：第一次无水乙醇处理2 min、第二次无水乙醇处理2 min、95%乙醇处理2 min、90%乙醇处理2 min、80%乙醇处理2 min、70%乙醇处理2 min和50%乙醇处理2 min。

步骤（5）中所述的乙醇脱水Ⅰ具体步骤为：50%乙醇脱水2 min、70%乙醇脱水2 min、80%乙醇脱水2 min、90%乙醇脱水2 min。

步骤（5）中所述的乙醇脱水Ⅱ具体步骤为：95%乙醇脱水2 min、第一次无水乙醇脱水2 min和第二次无水乙醇脱水2 min。

本发明方法中，三角帆蚌外套膜组织经过苏木精-伊红染色，最后用中性树脂封片，所制备的组织切片在显微镜下观察，然后记录、拍照。对外套膜各层细胞的形态及相对位置关系进行观察，以形成清晰、明了的三角帆蚌外套膜组织切片图。