[发明专利]一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点及应用

权利要求书

1.一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点，其特征在于：核苷酸序列为

加黑部分为引物序列，方框内是发生互换的碱基，划线处则是MboI限制性内切酶识别的酶切位点，箭头所示内切酶的切割部位。

2.根据权利要求1所述的一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点的检测方法，其特征在于：

乳母均由外周静脉抽取抗凝血5ml，用Wizard^?Genomic DNA Purification Kit试剂盒提取全血基因组DNA；步骤如下：1.5ml Eppendorf离心管中加入细胞裂解液900μl，加入融化的全血300μl吹打混匀，室温反应20min，以13000 rpm离心3min，吸弃上清，加入300μl核裂解液，充分振荡反复吹打至团块溶解，37℃水浴30min，加1.5μl RNase充分混匀，37℃水浴15min，加入100μl蛋白沉淀液，充分混匀，室温反应20min，以13000 rpm离心3min，将上清移至加入300μl异丙醇的离心管中，反复颠倒混匀，室温反应15min，以13000 rpm离心3min，轻轻弃上清，留白色沉淀，用吸水纸吸干，加70%乙醇200μl洗涤1次，离心轻轻弃上清，用吸水纸吸干，室温干燥20min，加100μl DNA溶解液，65℃水浴2h，制成DNA样品，于-20℃冰箱保存，使用美国BECKMAN公司的Du^?640紫外分光光度仪，分别取波长260nm、280nm 两个波段，测得其相应DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通过公式，计算出DNA含量，公式为：DNA含量=50mg/ml×OD260nm×稀释倍数，另外通过公式计算出DNA纯度，公式为：DNA纯度=OD260nm/OD280nm，依据相应的碱基序列合成引物，正向引物为：5’ AAGCAGGGACCTCAAGAC 3’，反向引物为：5’ AGCCCACCAAGAATGTAA 3’，PCR反应体系为20μl，其中含上下游引物各0.4μM， 8μl 2×Taq MasterMix ，DNA模板30～50ng，PCR扩增条件为：①94℃ 5min ②96℃ 30s，62℃ 60s，72℃ 35s 2个循环；③95℃ 30s，60℃60s，72℃ 35s 6个循环；④94℃ 55s，58℃ 60s，72℃ 35s 28个循环；⑤72℃10min，取PCR产物5μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子量标准品，所扩增的片段长度为153bp（6886371～6886683），在PCR扩增后的反应体系中，加入适量的限制性内切酶MboI及其酶切缓冲液，置37℃温箱5小时，经2.5%琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型，存在3种基因型，其中有完全切开的纯合基因型，未切开的纯合基因型，既有切开又有未切开的杂合基因型。

3.根据权利要求1所述的一个与乳汁多不饱和脂肪酸水平密切相关联的基因位点在指导孕妇及乳母营养摄取量的应用。