[发明专利]在基因转变活跃的细胞中实现遗传多样化的方法

说明书

本申请是申请日为2005年2月23日、申请号为200580008932.X、发明名称为“在基因转变活跃的细胞中实现遗传多样化的方法”的发明专利申请的分案申请。 

本发明涉及通过利用抗体生产细胞以及能产生所说遗传多样性的细胞和细胞系中免疫球蛋白基因转变（gene conversion）和超变（hypermutation）之间的关系对靶核酸序列或基因产物进行定向和选择性遗传多样化的方法，以及能够进行所述遗传多样化的细胞和细胞系。 

许多使基因产物产生多样性的方法依赖于产生非常大数目的突变体，然后用有力的选择技术对其进行选择。不过，这些体系有许多弊病。如果诱变是在体外对基因构建体进行的、并且随后将其用于体外表达或作为转基因在细胞或动物内表达，则所说的基因表达在生理学环境中是困难的且突变体库在时间上是确定的。另一方面，如果诱变是在活细胞内进行的，则将突变定向于预期的目标核酸就较困难。因此，通过重复循环进行足够有效的突变和选择来分离具有改良活性的分子的效率是有限的。而且，体内随机诱变是有害的，并且可能诱发高水平的有害次级突变。 

实际上，选定核酸序列的定向多样化发生在免疫球蛋白（Ig）基因座位的重排V(D)J区段中。抗体特异性的主要部分是通过包括连接免疫球蛋白V、D和J基因区段在内的DNA重排过程产生的。遇到抗原后，在那些表面免疫球蛋白可以较低的或中等的亲和力与抗原结合的B细胞中重排的V(D)J区段通过超变发生第二次多样化。这种所谓的体细胞超变产生了二级库，从中选择结合特异性增加的类型，从而使体液免疫反应发生亲和力成熟(Milstein和Rada,1995)。 

小鼠和人的免疫球蛋白基因座包含大集合的V、D和J基因区段，它们可参与V(D)J重排，从而在此阶段通过随机组合产生显著的多样性。诸如鸡、兔、牛、绵羊和猪等其它物种则采取不同的策略来发展它们的初级免疫球蛋白总组分(Butler,1998)。在一种功能性V和J 区段重排后，通过在特殊的淋巴器官－法氏囊内的基因转变产生鸡轻链基因的进一步多样化(Reynaud等,1987;Arakawa和Buerstedde,印刷中)。在此过程中，来自非功能性假V基因的序列段被转移入重排的V基因中。25种假V基因位于功能性V基因的上游并且与V基因享有序列同源性。与在人和小鼠中的情形相似，遇到抗原后的亲和力成熟通过超变在鸡的脾生发中心发生(Arakawa等,1996)。 

形成免疫球蛋白全部组分的所有三种B细胞特异性活性—基因转变(Arakawa等,2002)、超变和同种型转换重组(Muramatsu等,2000;Revy等,2000)都需要活化诱导型脱氨酶(Activation Induced Deaminase,AID)基因的表达。尽管AID起初被认为是DNA编辑酶(Muramatsu等,1999)，但近来的更多研究表明AID通过将胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶而直接修饰DNA(Di Noia和Neuberger,2002)。不过，胞嘧啶脱氨基活性必须被进一步调控，因为只有AID诱导的DNA修饰的类型、位置和过程有差异才能解释在不同物种和B细胞环境中重组或超变的选择性发生。根据某些AID突变影响转换重组但不影响体细胞超变这一发现，研究者认为AID需要结合辅因子来起始转换重组(Ta等,2003;Barreto等,2003)。 

对DT40敲除型突变体进行的分析表明，RAD54基因(Bezzubova等，1997)和RAD52重组修复途径的其它成员是有效的免疫球蛋白基因转变所必需的(Sale等，2001)。RAD51类似物和平行进化同源物的破坏减少了免疫球蛋白基因转变并诱发了重排的轻链基因内的超变(Sale等,2001)，表明通过同源重组进行DNA修复中的突变可将免疫球蛋白基因转变转变成超变。 

最近，已开发出第一种细胞体系，其中利用免疫球蛋白基因座内体细胞超变的现象以组成型和定向的方式产生靶基因的突变体。这些细胞体系使得我们可以通过突变产生和选择的循环步骤制备具有预期活性的基因产物。因而，WO00/22111和WO02/100998描述了能对某一特异核酸区域进行定向组成型超变的人伯基特淋巴瘤细胞系(Ramos)。此突变区可以是内源性重排的V区段或与指导超变的调控序 列可操作性连接的外源基因。此细胞体系的主要缺点在于人细胞不能通过定向整合进行有效的遗传操作，因为被转染的构建体主要在随机染色体位置处插入。