[发明专利]一种利用金纳米团簇测定糜蛋白酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定糜蛋白酶活性的方法，特别涉及一种利用金纳米团簇测定糜蛋白酶活性的方法。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质、肽键的一类酶的总称，参与了一系列生理和病理过程。许多疾病包括癌症、中风、感染、风湿性关节炎和炎症等都会影响到蛋白酶的正常活性。因此，通过蛋白酶活性的检测对疾病的诊断具有非常重要的意义。在目前采用的蛋白酶活性测量的方法中，荧光方法具有准确、快速、简单的优势。这些荧光方法的检测主要是采用荧光共振能量传递（FRET）技术，选用的荧光底物一般是标记有荧光染料的多肽，因此需要合成多肽和昂贵的荧光标记，检测成本较高。

金纳米团簇是由几个到几十个金原子组成核心，有机单分子或者蛋白质等作为保护基团组合而成的分子级聚集体。金纳米团簇作为一类新型纳米材料具有独特的光学特性，在催化、生物传感和生物成像上具有广泛的应用。金纳米团簇与金纳米颗粒的性质明显不同，金纳米团簇尺寸与电子的费米波长（<1nm）相当，由于其尺寸太小而不足以支撑其产生像金纳米颗粒一样的表面等离子体共振。金纳米团簇具有一些特殊的光学特性，如具有依赖与粒子粒径大小的荧光性质等。目前，金纳米团簇的制备方法主要是通过一些带有巯基的高分子、肽链、蛋白质和DNA来还原金前驱体。其中，采用蛋白质模板合成的金纳米团簇具有好的生物相容性和水溶性。采用牛血清白蛋白（BSA）合成金纳米团簇具有简单、绿色、“一锅煮”的优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用金纳米团簇的新用途，具体为金纳米团簇在测定糜蛋白酶活性中应用。

本发明还保护金纳米团簇在测定待测样品中糜蛋白酶含量中的应用。

本发明的再一个目的是提供一种利用金纳米团簇测定待测样品中糜蛋白酶含量的方法。

本发明所提供的利用金纳米团簇测定待测样品中糜蛋白酶含量的方法，具体可包括如下步骤：

（a1）将糜蛋白酶标准品或待测样品与金纳米团簇混合，形成实验反应体系；同时设置与所述实验反应体系相比缺少所述糜蛋白酶标准品或所述待测样品的空白反应体系；将所述实验反应体系和所述空白反应体系在同一条件下进行反应，反应结束后分别测定所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度，计算得到所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度差值；

（a2）根据步骤（a1）得到的所述糜蛋白酶标准品的所述荧光强度差值绘制标准曲线，将所述待测样品的所述荧光强度差值代入所述标准曲线，从而得到所述待测样品中糜蛋白酶的含量。

在上述方法中，步骤（a2）中，所述根据步骤（a1）得到的所述糜蛋白酶标准品的荧光强度差值绘制标准曲线，是以所述糜蛋白酶标准品的所述荧光强度差值为纵坐标，以所述糜蛋白酶标准品在含有所述糜蛋白酶标准品的所述实验反应体系中的终浓度为横坐标，绘制的标准曲线。

在上述方法中，所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度差值为反应后所述空白反应体系的荧光强度减去反应后所述实验反应体系的荧光强度。

在上述方法中，所述糜蛋白酶标准品可为系列浓度的糜蛋白酶标准品溶液，如浓度依次为50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml、25000ng/ml、50000ng/ml、250000ng/ml（相当于0.05U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL、5U/mL、25U/mL、50U/mL、250U/mL）的糜蛋白酶标准品溶液；所述糜蛋白酶标准品溶液的溶剂可为pH7～8.5的缓冲体系，在本发明的一个实施例中，所述糜蛋白酶标准品溶液的溶剂具体为50mM NH₄HCO₃水溶液。

在上述方法中，所述反应的温度可为35-40℃；所述反应的pH可为7-8.5；所述反应的时间可为50min-70min。在本发明的一个实施例中，所述反应的温度具体为37℃，所述反应的pH具体为7.8，所述反应的时间具体为1h。

在本发明的一个实施例中，所述反应的液体环境可为50mM NH₄HCO₃水溶液。

在上述方法中，所述待测样品中含有糜蛋白酶，且同时不含有可降解所述金纳米团簇包裹蛋白（如BSA）的其他蛋白酶。在本发明的一个实施例中，所述待测样品为用糜蛋白酶标准品配制的溶液，具体为将糜蛋白酶标准品溶于50mM NH₄HCO₃水溶液中得到的溶液；该溶液中糜蛋白酶的浓度为750ng/ml（即0.75U/mL）。