[发明专利]孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分离提取DNA技术领域。

背景技术

出生缺陷指婴儿出生时就存在的各种包括身体结构、智力或代谢等方面的异常。我国是世界上缺陷新生儿的高发国家之一，全国每年出生的2000万名新生儿有5%存在出生缺陷，每30秒就有一个缺陷儿出生。出生缺陷可由染色体畸变、基因突变等遗传因素引起,也可由这两种因素交互作用或其他不明原因所致。现有的科研成果显示基因突变在出生缺陷发生中发挥重要性，所以对胎儿DNA变异的产前筛查是降低出生缺陷的重要手段。

胎儿DNA变异检测的材料必须来自胎儿自身，传统的产前诊断是建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞遗传学诊断，虽然诊断准确，但因其操作有创伤性，易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿有一定的影响，属于侵入性检查。而孕妇血浆中胎儿游离DNA的提取只需要采集孕妇血浆标本，无需穿刺羊膜腔和插入绒毛组织，具有对胎儿无任何创伤、可在妊娠早期诊断等优点， 属于非侵入性胎儿遗传病产前筛查，安全而易于推广。

由于通常人类血浆中游离DNA的总浓度为1-100 ng/mL，胎儿DNA只占孕妇血浆中总DNA的5％ ～7％，比例较低。大量母源DNA背景无疑增加了对于胎儿游离DNA检测的难度，而且游离于母血中的胎儿DNA为短片断，一般小于200bp，不易捕获。因此，从孕妇外周血富集到高浓度和高纯度的胎儿DNA是开展非侵入性产前胎儿筛查的关键，需要开发专用技术。

人血浆或血清中纯化并浓缩游离DNA和RNA的技术和试剂盒主要用于血浆中总DNA的提取，不能满足从孕妇血浆或血清中纯化并浓缩胎儿DNA的需要，难以进行胎儿遗传病产前筛查，而且进口的试剂和试剂盒价格昂贵。中国专利200610013153.5公开了一种富集孕妇血浆中胎儿游离DNA的方法，能够有效提高孕妇血浆中胎儿DNA的提取率，但其对于胎儿DNA的提取率太低，难以保证产前筛查的准确性，不能满足胎儿遗传病产前筛查的要求。

发明内容

本发明提供一种孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，采用蛋白酶复合剂将蛋白质降解为小肽或氨基酸，从而实现DNA与蛋白质高效分离，提取液中胎儿DNA占总DNA的90%以上，能够满足胎儿遗传病产前筛查的需要，为开展非侵入性胎儿遗传病产前筛查提供必要的技术保障。

本发明所采取的技术方案是：

一种孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，包括下述步骤：

（1）采集孕妇外周血5-10mL，加入EDTA抗凝，4℃下1200-1700g离心5-10分钟，吸取上清液；

（2）在步骤（1）所得上清液中加入蛋白酶复合剂，4℃下1200-1700g离心5-10分钟，吸取上层水相；

（3）在步骤（2）所得上层水相中加入Tris饱和酚混匀，4 ℃下4000-4600g离心25-35分钟，吸取上层清液；

（4）在步骤（3）所得上层清液中加入氯仿/异戊醇混合液充分混匀, 4℃下4000-4600g，离心5-10 分钟，吸取上层水溶液；

（5）在步骤（4）所得上层水溶液中加入体积浓度为95 %的乙醇充分混匀，4 ℃下7000-9000g高速离心5-10 分钟，取得DNA沉淀；

（6）加20-100mL TE溶解DNA沉淀，TE溶解的DNA溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，选择切取目的条带固定，得到胎儿DNA粗回收液；

（7）胎儿DNA粗回收液用100-200mL无水乙醇沉淀DNA, 20-100mL TE溶解DNA沉淀，得到DNA提取液。

蛋白酶复合剂中蛋白酶K的浓度为5-20mg/mL、纤维蛋白溶酶的浓度为1000-5000pg/mL，木瓜蛋白酶的浓度为100-400ng/mL和胃蛋白酶的浓度为5-10ng/mL。

氯仿/异戊醇的混合液中氯仿/异戊醇的体积比为24：1。

步骤（2）中加入上清液总体积8-14%的蛋白酶复合剂。

步骤（3）中加入与上层水相等体积的Tris饱和酚。

步骤（4）中加入与上层清液等体积的氯仿/异戊醇混合液。

步骤（5）中体积浓度为95 %的乙醇的加入量为上清水溶液体积的1.5-3.0倍。

步骤（5）中所述乙醇的温度为4℃。