[发明专利]孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法有效
| 申请号： | 201310133487.6 | 申请日： | 2013-04-17 |
| 公开（公告）号： | CN103205416A | 公开（公告）日： | 2013-07-17 |
| 发明（设计）人： | 吴超群;管丽 | 申请（专利权）人： | 邯郸市康业生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 石家庄国为知识产权事务所 13120 | 代理人： | 夏素霞 |
| 地址： | 056107 河北省*** | 国省代码： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 孕妇 外周血中 胎儿 dna 提取 方法 | ||
1.一种孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于其包括下述步骤：
（1）采集孕妇外周血5-10mL，加入EDTA抗凝，4℃下1200-1700g离心5-10分钟，吸取上清液；
（2）在步骤（1）所得上清液中加入蛋白酶复合剂，4℃下1200-1700g离心5-10分钟，吸取上层水相；
（3）在步骤（2）所得上层水相中加入Tris饱和酚混匀，4 ℃下4000-4600g离心25-35分钟，吸取上层清液；
（4）在步骤（3）所得上层清液中加入氯仿/异戊醇混合液充分混匀, 4℃下4000-4600g，离心5-10 分钟，吸取上层水溶液；
（5）在步骤（4）所得上层水溶液中加入体积浓度为95 %的乙醇充分混匀，4 ℃下7000-9000g高速离心5-10 分钟，取得DNA沉淀；
（6）加20-100mL TE溶解DNA沉淀，TE溶解的DNA溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，选择切取目的条带固定，得到胎儿DNA粗回收液；
（7）胎儿DNA粗回收液用100-200mL无水乙醇沉淀DNA, 20-100mL TE溶解DNA沉淀，得到DNA提取液。
2.根据权利要求１所述的孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于所述蛋白酶复合剂中蛋白酶K的浓度为5-20mg/mL、纤维蛋白溶酶的浓度为1000-5000pg/mL，木瓜蛋白酶的浓度为100-400ng/mL和胃蛋白酶的浓度为5-10ng/mL。
3.根据权利要求１所述的孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于所述氯仿/异戊醇的混合液中氯仿/异戊醇的体积比为24：1。
4.根据权利要求１或2所述的孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于步骤（2）中加入上清液总体积8-14%的蛋白酶复合剂。
5.根据权利要求１或3所述的孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于步骤（3）中加入与上层水相等体积的Tris饱和酚。
6.根据权利要求１所述的孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于步骤（4）中加入与上层清液等体积的氯仿/异戊醇混合液。
7.根据权利要求１所述的孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于步骤（5）中体积浓度为95 %的乙醇的加入量为上清水溶液体积的1.5-3.0倍。
8.根据权利要求１所述的孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，其特征在于步骤（5）中所述乙醇的温度为4℃。
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