[发明专利]一种提取胡萝卜花粉小孢子的方法

说明书

技术领域

本发明的目的是提供一种提取胡萝卜花粉小孢子的方法。

背景技术

游离小孢子培养技术是一项发展较快的细胞工程技术，在多种作物中得到应用，如小麦、甘蓝、大白菜等，该技术能够利用花粉小孢子的离体培养快速获得纯合二倍体，从而创制出用于培育品种的新种质。胡萝卜游离小孢子培养技术已有研究（李金荣，欧承刚，庄飞云等.胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究，园艺学报，2011，38(8):1539-1546.），并获得胚状体植株，但数量较少，限制了该技术在胡萝卜生产中的广泛应用。产生这个问题的一个主要原因是胡萝卜花器官小，适宜培养时期的花蕾长约1mm，花药直径小于1mm，采用报道中所述方法很难充分挤压到花药并释放小孢子，因此获得的游离小孢子数量及诱导产生的胚状体数量较少，相应的最终获得的胚状体植株数也减少；并且在提取过程中，会产生大量体细胞组织杂质，影响最终的提取质量和培养效果。

现有胡萝卜花粉小孢子提取方法存在提取数量少、提取效率低等问题。目前，急需一种能够快速、高效、高质量分离胡萝卜花粉小孢子的提取方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种胡萝卜花粉小孢子的新型提取方法。该方法可以快速、高效分离胡萝卜花粉小孢子，提高单位操作中花粉小孢子的提取数量，增加培养数量，最终提高胚状体植株的获得量。

本发明所提供的提取胡萝卜小孢子的方法，具体可包括如下步骤：

（1）将经过消毒的胡萝卜花序置于直径为70～90mm（如90mm）的研钵（如陶瓷研钵）中，加入B5液体培养基，用锤头直径为25～30mm（如25mm）的研锤挤压花蕾释放小孢子，得到悬浮液；

（2）用400目孔径的滤网过滤步骤（1）所得的悬浮液，收集滤液；

（3）对步骤（2）所得的滤液依次按照如下（a）-（c）的步骤进行梯度离心，获得小孢子：

（a）150～155g（如153g）离心4～6min（如5min），弃上清，收集沉淀；

（b）用所述B5液体培养基悬浮步骤（a）所得沉淀，125～130g（如129g）离心4～6min（如5min），弃上清，收集沉淀；

（c）用所述B5液体培养基悬浮步骤（b）所得沉淀，105～110g（如106g）离心4～6min（如5min），弃上清，收集沉淀。

在所述方法的步骤（1）中，所述胡萝卜花序以小孢子处于单核晚期的胡萝卜花序为最佳。

在所述方法的步骤（1）中，所述胡萝卜花序与所述B5液体培养基的配比为15-20个所述胡萝卜花序：2mL所述B5液体培养基。

在本发明的一个实施例中，步骤（1）中，加入到所述直径为70～90mm的研钵中的所述胡萝卜花序具体为15-20个，加入的所述B5液体培养基具体为2mL。

在本发明的一个实施例中，所述方法的步骤（2）中，所述400目孔径的滤网为双层滤网。

在实际操作中，为了减少小孢子的损失，在所述方法中，在步骤（2）所述用400目孔径的滤网过滤步骤（1）所得的悬浮液之后，还包括如下步骤：用所述B5液体培养基冲洗所述研钵和过滤所述悬浮液后剩余的滤渣，得到冲洗液，并用所述400目孔径的滤网对所述冲洗液进行过滤，将此处所得滤液与前面过滤所述悬浮液所得的滤液合并。

在所述方法中，在步骤（1）所述挤压花蕾释放小孢子之后，还包括向所述研钵中加入所述B5液体培养基充分悬浮小孢子的步骤。在本发明的一个实施例中，此处所述B5液体培养基的加入量为5mL。

在所述方法中，在步骤（3）之后还包括用NLN液体培养基悬浮步骤3中步骤（c）所得沉淀，调整小孢子密度（如1.5×10⁵个/mL）以备用于培养的步骤。

在所述方法中，步骤（1）中，所述胡萝卜花序具体是按照包括如下步骤的方法进行消毒的：将待消毒的胡萝卜花序用清水洗净后，置于体积百分含量为75%的乙醇水溶液中浸泡30±5s（如30s）后，用为体积百分含量为10%的次氯酸钠水溶液浸泡15±2min（如15min），再用无菌水浸泡冲洗，得到步骤（1）中所述的经过消毒的胡萝卜花序。

在本发明的一个实施例中，所述提取胡萝卜小孢子的方法，具体包括如下步骤：

（a1）将小孢子处于单核晚期的胡萝卜花序用自来水冲洗后，用体积百分含量为75%的乙醇水溶液浸泡30s，用体积百分含量为10%的次氯酸钠水溶液浸泡15min，再用无菌水浸泡冲洗4次，每次1min，得到消毒后的所述胡萝卜花序；