[发明专利]乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。特别是一种乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。

背景技术

    氮的利用在农作物生产中占非常重要的地位，植物氮代谢及其调控一直备受全世界关注，氮肥利用率低及过量施用氮肥造成水环境污染的问题也是世界性难题。随着对植物氮同化过程中关键酶生理功能的研究日益深入, 通过基因工程的方法来提高植物氮素利用率将成为必然的趋势, 这对挖掘作物自身潜力以及高效利用土壤氮素养分资源, 实现现代农业持续发展具有重要意义。

    生物体的生长和发育过程中，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase ,GS）是生物体内氮同化路径上的关键酶，它和谷氨酸合成酶联合作用，催化NH4⁺同化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，将其酰胺转移到α-酮戊二酸上，从而生成两分子的谷氨酸。谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到了十分重要的作用。

    构建基因工程氮高效利用植物，优良的备选基因是关键的材料储备之一。细菌的谷氨酰胺合成酶涵盖了目前所发现的三大类谷氨酰胺合成酶GSI、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有种类多和容易克隆的优越性。乳球菌（Lactococcus sp.）是一种常见的革兰氏阳性土壤细菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能分析对新氮高效基因的鉴定并应用于改善逆境下农作物的生理性状有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一种谷氨酰胺合成酶基因。

本发明的目的之二在于提供了该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。

为达到以上目的，本发明通过下述方案实现：

   一种乳球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种根据上述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白的序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。

一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。

一种克隆上述的乳球菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：参考NCBI数据库中的乳球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，设计了兼并引物，从土壤微生物宏基因组DNA中PCR扩增得到不枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物为：LactocF: 5’-ATGACAATCACAGCAGCAGA-3’和LactocR: 5’-TTARTAAAGTTCTAARTART-3’。

上述的PCR扩增的条件为：94℃ 5分钟；94℃ 50秒，45℃ 50秒，72℃ 1分30秒，25个循环；72℃ 8分钟。

    本发明的互补实验验证了谷氨酰胺合成酶基因Lacto1所编码的谷氨酰胺合成酶能够在大肠杆菌中发挥谷氨酰胺合成酶的功能，能恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也预示了它在其他生物氮高效利用方面的应用价值。

附图说明

图1和2为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白亚细胞定位预测图，表明该编码蛋白定位在细胞质的可能性很大；

图3为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族；

图4为本发明的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017(Genotype: F-,[araD139]B/r,Δ(argF-lac)169,flhD5301,Δ(fruK-yeiR)725(fruA25),relA1,rpsL150(strR),Δ(glnG-glnA)229,ha-10,deoC1）中的功能互补分析图。培养基中添加谷氨酰胺，转入Lacto1和未转入Lacto1的菌株均可以正常生长；

图5为本发明的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017(Genotype: F-,[araD139]B/r,Δ(argF-lac)169,flhD5301,Δ(fruK-yeiR)725(fruA25),relA1,rpsL150(strR),Δ(glnG-glnA)229,ha-10,deoC1）中的功能互补分析图。培养基中未添加谷氨酰胺，只有转入Lacto1的菌株可以正常生长。

具体实施方式