[发明专利]一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及微生物发酵制药技术，具体涉及一种埃博霉素B的发酵生产方法。 

背景技术

埃博霉素是纤维堆囊菌产生的一种次级代谢产物，是一种十六元大环内酯类抗癌药物，它与抗癌药物紫杉醇一样具有促微管聚合作用从而抑制肿瘤细胞的增殖，并且与紫杉醇相比，埃博霉素具有毒性更小，水溶性更好，对耐药性细胞作用更强，抗肿瘤谱更广等优点，同时化学结构简单，易于进行修饰，引起了生物、医学、制药及有机合成等学科领域的高度重视，因此是目前学术界密切关注的、医药界寄予厚望的、前景广阔的一类新型抗肿瘤药物。目前埃博霉素B已进入临床研究。 

埃博霉素生物合成的调控机制并不清晰，综合文献可知，埃博霉素B的内酯环是由3个乙酸单位、4个丙酸单位和一个噻唑环缩合形成的，而乙酸单元和丙酸单元分别是以丙二酸单酰辅酶A和甲基丙二酸单酰辅酶A为前体的。目前埃博霉素B的产量还比较低，且不稳定，受培养条件和环境的等因素的影响很大。 

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，能够提高埃博霉素B的产量，同时降低发酵成本。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤： 

1）将纤维堆囊菌接种于M26培养基中，在25～35℃下摇床培养72～120h，得到种子液； 

2）按100ml接种5～15ml的比例，将种子液接种至含有树脂的发酵液中，在25～35℃下摇床培养72～120h，在培养0～72h内向含有树脂的发酵液中添加前体物和/或小分子物质，所述的前体物为乙酸钠、丙酸钠、半胱氨酸中的一种或几种，小分子物质为甲基丙二酸、脂肪族类氨基酸、亚铁氰化钾、生物素中的一种或几种； 

3）将培养后的发酵液过滤，收集树脂，树脂经水洗涤后再经甲醇振荡，得到含有埃博霉素B的浸提液。 

所述乙酸钠、丙酸钠、甲基丙二酸的用量为0.25～7mmol/L，半胱氨酸及脂肪族类氨基酸的用量为40～80umol/L，亚铁氰化钾的用量为1×10^-5～3×10^-5mol/L，生物素的用量为：1～10ug/L。 

所述的脂肪族类氨基酸为蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸中的一种或几种。 

培养初始向含有树脂的发酵液中分别按5～8ug/L、40～60umol/L、30～50umol/L的量添加生物素、蛋氨酸和半胱氨酸。 

培养初始向含有树脂的发酵液中分别按5～8ug/L、40～60umol/L、30～50umol/L的量添加生物素、缬氨酸和半胱氨酸。 

培养初始向含有树脂的发酵液中按5～8ug/L的量添加生物素，发酵培养48h后分别按4～7mmol/L、4～7mmol/L、50～70umol/L的量添加乙酸钠、甲基丙二酸和半胱氨酸。 

培养初始向含有树脂的发酵液中按5～8ug/L的量添加生物素，发酵培养48h后分别按4～7mmol/L、0.3～3mmol/L、50～70umol/L的量添加乙酸钠、丙酸钠和半胱氨酸。 

所述的含有树脂的发酵液中树脂的添加量为15～30ml/L，添加的树脂为大孔树脂XAD16。 

步骤1）、2）所述的摇床培养振荡速度为150～180r/min；步骤3）所述的 过滤为采用20～60目铁丝滤网夹筛过滤收集树脂。 

所述的发酵液中含有酵母粉20～50g/L、玉米淀粉1～5g/L、磷酸二氢钠1～2g/L、磷酸氢二钠1～2g/L、MgSO₄·7H₂O2～5g/L、FeSO₄·7H₂O0.1～0.5g/L、CaCl₂2～5g/L、MnCl₂0.1～0.5g/L和葡萄糖10～15g/L，调节pH值为7.2～7.5。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：