[发明专利]一种海洋细菌新型酯酶及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋细菌新型酯酶及其制备方法与应用。具体的说，涉及海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2^T中酯酶基因pe8及利用该酯酶手型催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。 

背景技术

光学纯的(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯是一系列重要医药中间体的前体。其中最具代表性的是左旋帕罗西汀盐酸盐。它可以使突触间隙中的5-羟色胺（5-HT）浓度增高，发挥抗抑郁作用，对其它递质作用较弱，对植物神经系统和心血管系统的影响较小，作为选择性中枢神经5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂（SSRI）。临床上被广泛应用于治疗抑郁症，强迫症，惊恐障碍或社交焦虑障碍等疾病。近年来，抗抑郁药物帕罗西汀在国内外的市场需求与日俱增，其合成方法也在全球备受关注。因此，探索其简便，高效经济的制备方法成为科学界十分活跃的课题。合成的方法有化学法和酶法，而酶法由于它的高效、绿色和环保等优点成为研究的首选。 

Yu等（TetRahedRon Lett.41(2000),5647-5651.）用猪肝脏酯酶 选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，得到(S)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，虽然ee值与产率高达95%和86%，但是S构型的产物并不是合成左旋帕罗西汀正确构型前体。 

Lopez-GaRcia等（TetRahedRon AsymmetRy.14(2003),603-609.）在有机溶剂中对3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯进行氨解反应，虽然取得了较高的ee值但产率却不尽如人意。 

最近，Liu等（PRocess Biochem.47(2012),1037-1041.）利用来自于Candida antaRctica的固定化脂肪酶（Novozym435）催化该反应，得到(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯,虽然产率和ee值都很高，但是由于商品化酶昂贵的价格，不适用于大规模工业化生产。 

由于海洋微生物酯酶通常具有与其生存环境相关的特性，譬如良好的耐盐性、耐热性和良好的手性选择性等，为此我们克隆了海洋细菌PelagibacteRium halotoleRans B2^T中酯酶基因pe8并将其在大肠杆菌Rosetta中高度可溶性表达。本发明利用该酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯进而生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。通过对其反应条件的优化，使其转化率和手性选择性大大提高。由于该酶能在表达菌株中高度可溶性表达，并且表现出良好的耐盐、耐碱性及手性选择性，因此可以作为工业化生产抗抑郁药物中间体的潜在用酶。 

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋细菌新型酯酶、其编码基因及其制备方法，以及利用该酯酶生产(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方 法。 

本发明通过PCR方法，从新型海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2^T中意外克隆到一种新型酯酶PE8。海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2^T系发明人之一许学伟等从东海海水样品中分离得到（相关论文发表于International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology；2011；61：1817–1822），该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并可提供给公众使用，保藏编号为CGMCC1.7692^T，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所（100101），保藏日期为2008年6月。 

本发明将目前发表的所有酯酶按照不同的家族进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列，然后利用相关软件(例如CODEHOP)寻找可能的兼并引物。依据引物的基本原则和要求:简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的TM值尽可能相近等，选择适宜的兼并引物。