[发明专利]新型麦芽寡糖基海藻糖水解酶、酶基因、含该基因的重组表达载体及重组工程菌及酶的制备

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因、含有该基因的重组表达载体及重组工程菌，以及利用含有该基因的重组工程菌制备该酶的方法。

背景技术

海藻糖 (Trehalose)是一种由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以α -1,1糖苷键结合的非还原性糖，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，相对分子量为378.33。其结构式如图1所示：

图1  海藻糖的分子结构

海藻糖广泛存在于细菌、酵母、真菌、藻类、昆虫和植物中。它对生物体和生物大分子具有非特异性的保护作用。这种非特异性保护作用主要体现在，当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、低温冷冻、辐射、高渗透压及有毒试剂等各种胁迫环境时，胞内海藻糖含量迅速上升，从而保护生命本身。

外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有非特异性的保护作用，海藻糖这种独特的生物学性质，使其广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。

目前海藻糖的生产工艺分为三种：

（1）提取法

酵母在恶劣的环境下（饥饿、高温、高渗、高压）生长，酵母体内能够积累大量海藻糖，大约占菌体干重的15%。因此最初海藻糖的生产采用从酵母体内提取的方法。在酵母细胞内，由于海藻糖属胞内产物，合成受外界环境条件的影响较大，且分离提取困难，因而用此法生产海藻糖的产量较低，商品化生产的发酵水平为0.4-0.6%，成本较高，此种生产方法海藻糖价格昂贵。

（2）单酶法

1995年，日本林原生化研究所从Pimelobacter、Psceuclomonus和Thermus三属微生物中分离纯化了一种新型淀粉酶—海藻糖合酶，它可以转化麦芽糖为海藻糖，并申请了专利CN1106065A。此后我国科研单位也相继从不同细菌中发现了海藻糖合酶并进行基因工程表达，例如CN200410013007.3、CN200910114318.1、CN200910007259.8、CN201010614814.6、CN201010614832.4、CN201210160403.3、CN201210011457.3，其中栖热菌属海藻糖合酶具有80℃的热稳定性。随着反应温度升高，海藻糖合酶转化麦芽糖生产海藻糖的转化率会下降，40℃麦芽糖对海藻糖的转化率可达到80%，60℃转化率约为60%。目前还没有利用该工艺大规模生产海藻糖的报道。

（3）双酶法

1994年林原生化研究所发现了新型海藻糖合成酶—麦芽寡糖基海藻糖合成酶（malt ooligosyl tehalose synthase，MTSase）和水解酶（maltooligosyl trehalose hydrolase, MTHase），双酶联合作用于淀粉水解物产生海藻糖，首先MTSase作用于淀粉水解物，淀粉水解物末端形成海藻糖单元，然后MTHase切割掉末端海藻糖，形成一分子海藻糖和少两个葡萄糖基的淀粉水解物。

目前以还原性淀粉水解物为原料，双酶转化生产海藻糖是最经济的工艺路线，仍存在以下问题：

（1）专利CN99123896.6提供了最适温度50℃和最适pH6.0的MTSase和MTHase，转化率可达到80%，目前日本林原生化研究所已利用该技术实现大规模生产。50℃双酶转化容易染菌，此外淀粉水解物需要普鲁兰酶脱支处理。目前商品普鲁兰酶最适温度为55-60℃，最适pH5.0-5.5，pH6.0时活力较低，导致普鲁兰酶和双酶共同转化淀粉生产海藻糖时效率较低，转化时间达到48 h以上。

（2）文献Production of Trehalose from Starch by Thermostable Enzymes from Sulfolo bus acidocaldarius（DOI:10.1002/star.19970490107）报道了嗜酸热硫化叶菌可产最适温度75℃和最适pH5.5左右的MTSase和MTHase。该双酶虽然具有较高的最适反应温度和较低的最适pH，但是文献报道该双酶活力均很低。

发明内容

本发明提供了一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶（简称MTHase，下同），该酶具有较高的最适反应温度和热稳定性，提高了生产海藻糖的稳定性，和普鲁兰酶具有相同的最适pH，显著提高了其和普鲁兰酶联合生产海藻糖的效率。

本发明还提供了一种表达该水解酶的基因、含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，该基因表达量高，使酶成本显著降低，也进一步降低了制备海藻糖的成本。