[发明专利]一种犬细小病毒乳胶检测试剂及检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明是属于临床宠物免疫学技术领域，涉及免疫学、化学等相关领域。具体涉及一种犬细小病毒乳胶检测试剂，还涉及一种犬细小病毒乳胶凝集检测的方法，还涉及一种犬细小病毒乳胶在体外检测犬细小病毒中的应用。

背景技术

犬细小病毒病是由犬细小病毒引起犬科动物的一种烈性传染病。临床分为出血性肠炎和非化脓性心肌炎两个类型。无论哪种类型的临床表现，都以发病率高、死亡率高和传染性强为特点，是危害养犬业的最为严重的传染病之一，给犬养殖业造成了严重的经济损失。近年来随着养犬数量的不断增多和养犬规模的不断扩大，致使犬细小病毒病日趋流行，加之该病发病急死亡率高，危害日渐严重。

1977年，美国学者Eugster和Nairn最先从患出血性肠炎的犬粪便中分离得到该病毒，其后，加拿大、澳大利亚、法国、日本等国均有报道了类似CPV所致的犬出血性肠炎；1983年，徐汉坤等正式确认本病的流行。犬细小病毒的发现虽然只有30年的时间，但该病毒对犬的感染危害严重。

目前检测犬细小病原的方法主要有聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针技术、胶体金检测、酶联免疫吸附反应（ELISA）、血凝/血凝抑制试验（HA/HI）等。PCR具有高度的敏感性和特异性，但需要PCR仪和凝胶成像系统等价格昂贵的设备，虽然用煮沸的方法提取病毒DNA大大缩短了繁琐的苯酚—氯仿异戊醇提取DNA所耗费的时间，但反应结果也需要3h左右才能得到。HA/HI的灵敏性较低，试验需要新鲜健康的猪红细胞，需要3h才能读取结果，而且犬细小病毒也出现了没有血凝活性的变异株，造成试验结果的不准确。鉴于HA/HI与PCR和ELISA方法自身所限及目前我国宠物医疗的门诊条件，这几种方法都难以在宠物医疗门诊推广。乳胶凝集检测迅速，不需要特殊的仪器和专门的技能，具有很大的优势。目前临床上使用的主要是胶体金抗原检测试剂盒，但是价格比较昂贵，本发明旨在给宠物医院提供一种快速、简便、便宜的检测方法。

迄今为止，CPV只有一个抗原型，即CPV-2，但不同的毒株间抗原性有所差异，已出现了多个亚型。即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)。通过对各种犬细小病毒的核苷酸对比分析，他们之间的同源性高达98%以上。与流感病毒不同，这种病毒的变异，是通过病毒核苷酸的突变，而不是重组实现的。我国的CPV分离株也存在基因变异的现象，但是我国CPV分离株与参考株的核酸同源性超过98%，没有形成明显的中国CPV分支。本实验室制备的抗是CPV-2b亚型的单克隆抗体。

从上个世纪中叶聚苯乙烯乳胶颗粒开始做凝集试验的材料以来，由于具有独特的优点，如：操作简便，不需要特殊仪器，肉眼可断，也不需要对操作过程进行培训；时间短，一般在2分钟内可以出结果；价格低廉，检测单份血清样品比其他血清学、病原学方法便宜得多；适用于现场检测等，在临床上得到了广泛的应用。传统的乳胶凝集试验是以惰性聚苯乙烯乳胶颗粒作载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到相应的抗体或抗原成分时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。在利用乳胶凝集技术建立病原学检测方法时，一般是将特异性抗体致敏到乳胶颗粒表面，普通聚苯乙烯乳胶和抗体的结合是无选择性的物理静电吸附，由于抗体的分子量小，很难结合到乳胶表面，即使致敏上的抗体也容易从乳胶颗粒上脱落或者变性失活，导致致敏好的乳胶试剂保存期短，难以适合产品开发的需要。为此，本申请人以带有羧基基团（-COOH）的羧化聚苯乙烯胶乳为载体，以双功能试剂水溶性碳化二亚胺（EDC）为介质，经化学反应将抗体（IgM）分子偶联到乳胶表面。本发明克服了普通乳胶致敏抗体时，致敏量少，不稳定，抗体容易脱落等缺点，提高了抗体的结合效率，而且致敏上的抗体不容易从乳胶上脱落，进而提高乳胶的敏感性和保质期，适合了产品开发和大规模生产的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种犬细小病毒乳胶检测试剂，由犬细小病毒单克隆抗体和乳胶组成。该试剂具有特异性强，灵敏度高，检测时间短的特点。

本发明还有一个目的在于提供了一种犬细小病毒乳胶凝集检测方法，该方法简单，易于操作，准确率高。