[发明专利]通过构建“大小染色体”高效敲除大肠杆菌基因组的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因组工程和分子生物学领域，具体涉及大肠杆菌生存必需基因在酵母中的拼接克隆和验证，并将正确拼接的质粒转入大肠杆菌。然后对大肠杆菌染色体中包含已克隆的生存必需基因的大片段DNA进行敲除。

背景技术

大肠杆菌是基础研究最透彻，工业应用最广泛的模式菌株。研究表明，大肠杆菌基因组中只有7-15%左右的基因为生长所必需（1,2）。通过敲除生长非必需的基因，可以获得遗传更为稳定及背景更清晰的大肠杆菌菌株，有利于更好地研究其调控机制。具有减小基因组的细胞也减少了非必需的代谢途径，有利于获得高产的优化菌株。通过连续删除生长非必需区域，目前已经将大肠杆菌的基因组从4.6M删减到了2.9M，基因组减小了39%（3）。

传统的基因组敲除方法必须跳过大肠杆菌基因组中的生存必需基因，因此敲除片段的大小受到很大的限制，敲除速度较为缓慢（5）。与现有的基因组敲除方法相比，本发明能更快速和高效地删减大肠杆菌基因组。

发明内容

本发明旨在加快大肠杆菌基因组敲除的速度。通过将大肠杆菌生存必需基因拼接克隆到单拷贝载体上，然后可快速敲除染色体中包含已克隆的生存必需基因的大片段DNA，敲除速度大大提高。

本发明公开了一种通过构建“大小染色体”高效敲除大肠杆菌基因组的方法。通过将大肠杆菌基因组中不能被敲除的生存所必需的基因拼接并克隆到单拷贝的载体上，称为“小染色体”；然后利用精确打靶的方法可将大肠杆菌原染色体上对应的大片段区域敲除，称为“大染色体”。同常规的基因组敲除方法只能跳过生存必需基因而敲除基因组中较小的片段相比，本发明可以一次敲除更大的片段，从而大幅度加快基因组敲除的速度。此外，利用本发明，在回补了已知生存必需基因而不能敲除基因组中对应的区域时，通过进一步的将该区域细分，可以定位出可能存在的新的生存必需基因或调控元件。

本发明高效敲除大肠杆菌基因组的方法具有下列特征：

1）在大肠杆菌生存必需基因的选择上，不仅收集了单基因敲除和基因回补等实验数据，还包含了在生化和代谢途径等生物信息学预测中认为组成一个完整生命体的最小基因集合，因此为目前已知的较为完整的大肠杆菌生存必需基因集合；

2）构建的酵母-大肠杆菌穿梭载体pXX11，在酵母和大肠杆菌都能稳定存在，且均为单拷贝。利用该载体可在酵母体内高效拼接和克隆多个DNA片段；

3）回补了大肠杆菌生存必需基因后，将染色体上对应的大片段区域分成较小区域进行平行敲除，迅速对染色体上可敲除区域进行初步筛查。对于连续的可敲除的较小区域可并在一起进行大片段的一次敲除，提高了敲除速度；

4）对于已回补了生存必需基因，但对应的染色体区域仍不能敲除的，可进一步分小段敲除并定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件。本发明选择已经商业化的菌株MDS42（购自SG公司（Scarab Genomics））为出发菌株，该菌株敲除了前噬菌体、转座子、插入系列等DNA片段，基因组更稳定并减小了14%（4）。

本发明提供一种包括骨架载体的核酸序列，其中所述骨架载体能在酵母和大肠杆菌中稳定存在。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体在酵母和大肠杆菌中均为单拷贝。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体包括酵母载体复制区和筛选标记以及Bac载体的复制区、分配区和筛选标记。酵母载体复制区是酵母载体中用于控制其自主复制的区域。Bac载体的复制区是Bac载体中用于控制其自主复制的区域。Bac载体的分配区是Bac载体中用于控制其拷贝数的区域。筛选标记是用于选择性筛选分别的阳性转化子的基因。

在一个具体实施方式中，本发明所用的酵母载体为pSH47，本发明所用的Bac载体为pBeloBAC11。

在一个具体实施方式中，酵母载体复制区为CEN6ARS4，筛选标记为URA3；在一个具体实施方式中，Bac载体复制区包括复制起始ori、repA，分配区包括调控基因sopA、sopB、sopC，筛选标记为Cm。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体具有SEQ ID NO:1所示的序列。

在一个具体实施方式中，本发明所用骨架载体为穿梭质粒pXX11。

本发明提供一种敲除大肠杆菌基因组的方法，所述方法包括：

1）将至少一个骨架载体与2个以上大肠杆菌生存必需基因串联拼接后转化大肠杆菌；