[发明专利]通过构建“大小染色体”高效敲除大肠杆菌基因组的方法

权利要求书

1.一种包括骨架载体的核酸序列，其特征在于，所述骨架载体在酵母和大肠杆菌中均为单拷贝并且包含2个以上串联的大肠杆菌生存必需基因。

2.如权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述骨架载体包括酵母载体复制区和筛选标记以及Bac载体的复制、分配区和筛选标记。

3.如权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述骨架载体具有SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

4.一种包含如权利要求1-3中任一项所述的核酸序列的大肠杆菌，其特征在于，所述核酸序列以游离的质粒形式存在或者整合到大肠杆菌基因组中。

5.一种敲除大肠杆菌基因组的方法，所述方法包括：

1）将至少一个骨架载体与2个以上大肠杆菌生存必需基因串联拼接后转化大肠杆菌；和

2）敲除大肠杆菌基因组或其片段。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述敲除为平行敲除。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤2）中敲除的大肠杆菌基因组或其片段包含步骤1）所述的2个以上大肠杆菌生存必需基因。

8.一种定位生存必需基因或调控元件的方法，所述方法包括：

1）将至少一个骨架载体与2个以上大肠杆菌生存必需基因串联拼接后转化大肠杆菌；

2）敲除大肠杆菌基因组或其片段；和

3）对于已回补了生存必需基因，但敲除包含该基因的染色体区域后仍导致大肠杆菌无法生存的情况，进一步分段敲除该区域并定位可能存在的新的生存必需基因或调控元件。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2）中敲除的大肠杆菌基因组或其片段包含步骤1）所述的2个以上大肠杆菌生存必需基因。

10.一种核酸序列，所述核酸序列具有如SEQ ID NO:1所示的序列。