[发明专利]一种L-谷氨酸基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵及基因工程领域，具体涉及一种能够提高L-谷氨酸产量的基因工程菌、其构建方法及其在生产L-谷氨酸上的应用。

背景技术

谷氨酸（Glutamic acid），其学名为2-氨基-5-羧基戊酸，是构成蛋白质的20种常见氨基酸之一，在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。L-谷氨酸是谷氨酸的左旋体，其具有增鲜、降低血氨、改善中枢神经系统、改善儿童智力发育、扩张血管、增强血液循环、促进花穗发育等功能，并且可以生产许多重要的下游产品，如L-谷氨酸钠、L-苏氨酸、聚谷氨酸等，被广泛应用于食品、医药、人造制革、化妆品、农业等行业。

谷氨酸的制备起始于18世纪。1866年德国化学家从小麦面筋的水解物中提取得到谷氨酸，1957年日本率先采用微生物发酵的方法生产谷氨酸，因发酵法具有原料成本低、反应条件温和、可大规模生产等优点，目前仍是谷氨酸生产的主要方法。目前我国发酵生产谷氨酸的菌种主要包括谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)、钝齿棒杆菌(Corynebaclerium crenalum)、北京棒杆菌(Corynebaclerium pekinense)、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）以及它们的突变株，如天津短杆菌T613的突变株TG-916、FM-415、CMTC6286、S9114等，钝齿棒杆菌AS1.542的突变株B9、F-263，北京棒杆菌AS1.299的突变株7338、D110、WTH-1等。

上述谷氨酸生产菌主要是通过选育及诱变育种的方式获得，其产酸能力伴随着谷氨酸发酵生产的发展获得了很大的提高。然而在现有的产酸能力下，继续采用经典微生物育种的方式来选育菌种，以期达到大幅度提高产酸率和糖酸转化率已经相当困难。近年来，随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032基因组测序的完成以及谷氨酸棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造成为现实。

谷氨酸的生物合成的途径包括糖酵解作用（EMP途径）、磷酸戊糖途径（HMP途径）、三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路等。在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要反应包括谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应、转氨酶（AT）所催化的转氨反应以及谷氨酸合成酶（GS）所催化的合成反应，其中还原氨基化反应为主导反应。由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想代谢途径是先通过EMP和HMP途径生成丙酮酸，丙酮酸一部分在丙酮酸脱氢酶系统作用下生成乙酰CoA，另一部分经CO₂固定反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶的催化下合成柠檬酸，进入TCA循环，最终生成α-酮戊二酸，其经谷氨酸脱氢酶作用经还原氨基化作用生成谷氨酸，此时理论糖酸转化率为81.7%。

日本味之素株式会社依据谷氨酸合成的代谢途径对谷氨酸生产菌种作了一些基因改造，如在公开号为CN1261627A的中国发明专利中公开了通过在培养基中培养属于肠细菌并具有L-谷氨酸生成能力的引入了来自棒状细菌的柠檬酸合成酶基因微生物来生产L-谷氨酸；在CN1270226A中公开通过增加编码细胞内丙酮酸脱氢酶的基因的拷贝数获得的增强的细胞内丙酮酸脱氢酶活性和具有谷氨酸生产能力的棒杆菌细菌；在CN1938418A中公开通过在培养基中培养其中L-谷氨酸输出基因YHFK基因的表达增强或过表达的微生物以产生并导致L-谷氨酸在培养基中累积等。

除了上述酶外，在谷氨酸生物合成代谢途径中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO₂固定化从而使磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的关键酶，如CO₂固定反应不起作用，则丙酮酸将全部氧化成乙酰CoA，再通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸，此时理论糖酸转化率仅为54.4%，因此通过该酶的过量表达可能提高谷氨酸的发酵水平。此外，谷氨酸脱氢酶是谷氨酸合成途径中另一个关键酶，该酶催化α-酮戊二酸还原生成L-谷氨酸且受L-谷氨酸的反馈作用，因此过表达该酶可解除L-谷氨酸的反馈作用，从而达到提高产量的目的。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种依据代谢工程理论来通过分子生物学方法构建的谷氨酸基因工程菌，对该基因工程菌进行发酵可以显著提高L-谷氨酸的产量以及糖酸转化率。