[发明专利]一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法

权利要求书

1.一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，其特征是该方法包括如下步骤：

一、植物叶绿素荧光的数据收集与分析；

二、化感作用对植物叶绿素变化的验证。

2.根据权利要求1所述的一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，其特征是所述的步骤一、化感作用植物叶绿素荧光的数据收集与分析；具体包括，

1、实验材料：

基础型调制型叶绿素荧光仪（Junior-Pam，Heinz Walz GmbH，D91090，Effeltrich）；一次性塑料培养皿15皿；预培养20天的井栏边草配子体；

2、实验处理设计：

1）取预培养20天的井栏边草配子体，放入10mL设置质量浓度梯度分别为100%、50%、25%、12.5%以及0%的根系分泌物的水浸液的一次性塑料培养皿中，保持每皿100枚配子体，每组质量浓度梯度有三个平行组；实验时间为10天，在第2、4、6、8、10天进行叶绿素荧光检测；

2）组装Junior-Pam荧光仪：将光纤的一端插到Junior-PAM主机的光纤接口，轻轻的将光纤插到底，锁紧；将光纤另一端插到磁性叶夹，调节光纤末端到样品的距离为1mm； 用USB线将Junior-PAM主机和电脑（支持Windows 7）连接好；启动WinControl-3软件，软件启动后自动搜索仪器接口，搜索成功后直接进入WinControl-3主界面； 

3）设置光化光光强PAR为66μmol photons·m^-2·s^-1；数据采样时间为2分钟；数据采样频率为5s/次； 

4）将装有配子体的培养皿用黑色布料覆盖，暗处理5分钟；

5）用镊子取出一枚配子体，放入磁性叶夹中，固定，使用WinControl-3软件开始记录；记录数据内容为

固定荧光Fo：当光系统Ⅱ反应中心都处于开放状态时的最小荧光值；

最大荧光产量Fm：暗适应后执行饱和脉冲当光系统Ⅱ反应中心都处于关闭状态时的最大荧光产量；

光下最小荧光值Fo’ ；

光下最大荧光Fm’：光下执行饱和脉冲当光系统Ⅱ反应中心都处于关闭状态时的最大荧光产量；

中执行饱和脉冲前的实时荧光产量F’ ；

沼泽模型qP和湖泊模型qL：光化学淬灭系数；

基于跨膜质子梯度qN和玉米黄质梯度模型NPQ；非光化学淬灭参数；

光系统Ⅱ调节非能量耗散的量子产量Φ_NO和光系统Ⅱ调节能量耗散的量子产量Φ_NPQ：非光化学淬灭的量子产量；

相对电子传递速率ETR；

实际光合量子产量Φ_PSII；

6）2分钟后，脉冲停止，保存数据；

7）选取具有代表性的5个参数进行分析：实际光合量子产量Φ_PSII、相对电子传递速率ETR、基于跨膜质子梯度qN、湖泊模型qL 和最大荧光产量的比值参数=可变荧光量Fv/ 最大荧光产量Fm；式中的Fv=Fm-Fo；

3、数据分析：

1）实际光合量子产量分析，实际光合量子产量在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的实际合量子产量没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，实际光合量子产量基本呈现12.5%>25%>50%>100%，即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高实际光合量子产量呈下降的趋势，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势；

2）相对电子传递速率ETR值的分析，相对电子传递速率ETR值在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的相对电子传递速率没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，相对电子传递速率基本呈现12.5%>25%>50%>100%，即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高相对电子传递速率下降的趋势，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势；

3）非光化学淬灭参数qN的分析，非光化学淬灭参数qN是基于跨膜质子梯度和玉米黄质的非光化学淬灭相关性模型，反应叶绿素热耗散引起的荧光淬灭，在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的非光化学淬灭参数qN没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，非光化学淬灭参数qN基本呈现12.5%<25%<50%<100%，即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高非光化学淬灭参数qN呈上升的趋势，说明三叶鬼针草根系分泌物能增加叶绿素的热耗散，造成光合效率降低，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势；

4）光化学淬灭系数qL的分析，光化学淬灭系数qL是基于湖泊模型的光化学淬灭系数，反应了PSII反应中心的开放程度，在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的光化学淬灭系数qL没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，光化学淬灭系数qL基本呈现12.5%>25%>50%>100%，即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高光化学淬灭系数qL呈下降的趋势，说明了三叶鬼针草根系分泌物对井栏边草配子体光系统II反应中心产生抑制作用，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势；

5）比值参数Fv/Fm的分析，比值参数Fv/Fm体现了光系统Ⅱ的最大量子产量，反应了植物的潜在最大光合能力和光合效率，在0%浓度的三叶鬼针草根系分泌物处理时，井栏边草配子体的比值参数Fv/Fm没有发生显著变化；在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，比值参数Fv/Fm基本呈现12.5%>25%>50%>100%，即随着三叶鬼针草根系分泌物浓度升高比值参数Fv/Fm呈下降的趋势，说明了三叶鬼针草根系分泌物能减少井栏边草配子体的最大量子产量，并且能抑制井栏边草配子体的光合效率，得证随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势。

3.根据权利要求1所述的一种用叶绿素荧光验证植物化感作用的方法，其特征是所述的步骤二、化感作用对植物叶绿素变化的验证，具体包括：

1、实验步骤：

1）取100%、50%、25%、12.5%以及0%的根系分泌物的水浸液的配子体0.025g，用无水乙醇-丙酮=1:1的混合液浸泡10h，至配子体完全变为无色；

2）使用可见光分光光度仪（SP-2100）测定配子体的叶绿素提取液在470nm、647nm和663nm处的吸光值；

2、数据分析：

1）计算公式：

叶绿素a含量(Chla)=12.21×OD₆₆₄－2.81×OD₆₄₇；

叶绿素b含量(Chlb)=20.13×OD₆₄₇－5.03×OD₆₆₄；

类胡萝卜素含量(Car)=(1000×OD₄₇₀－3.27Chla －104Chlb)/229；

总叶绿素量=（叶绿素a+叶绿素b+类胡萝卜素）×5/1000/0.025；

2）分析叶绿素a和叶绿素b与时间的变化，根据叶绿素a和叶绿素b与时间的变化能推断，三叶鬼针草根系分泌物对井栏边草配子体的叶绿素a和叶绿素b呈现随浓度和时间的增加相应减少的趋势，说明了三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势，同时也对叶绿素荧光参数分析进行了验证；

3）分析类胡萝卜素的含量与三叶鬼针草浓度和时间的变化，根据类胡萝卜素的含量与三叶鬼针草浓度和时间的变化能推断，随浓度和时间的推移，类胡萝卜素的含量呈下降趋势；

4）分析叶绿素总量，从叶绿素总量的分析能得证三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势，与叶绿素荧光分析实验结论相同，同时也对叶绿素荧光参数分析进行了比对和验证。