[发明专利]一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因敲除的细胞的制备方法和应用。

背景技术：

艾滋病（AIDS）是由艾滋病病毒（HIV）感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。研究表明CCR5是HIV入侵细胞最重要的共受体，世界上有一小部分人群的CCR5基因天然存在着32个碱基的缺失（CCR5△32），他们不易被HIV感染且能够正常的生活。一位同时感染了HIV的白血病人接受CCR5Δ32/Δ32的供体造血干细胞（HSCs）骨髓移植，停止HAART治疗20个月后，没有出现病毒的反弹，随后观察到该病人免疫系统成功重建，病毒储存库随着时间的推移也在减小。这是世界首例通过干细胞移植获得治愈的艾滋病患者。但这种治疗手段并不能广泛应用，因为CCR5△32纯合子的人只有极少的一部分，难以找到同配型的CCR5△32供体进行骨髓造血干细胞移植。

以转录激活因子样效应因子核酸酶（TALEN）为代表的基因打靶技术可以实现指定基因的靶向性敲除。利用这种技术即可以人为的将野生型的CCR5突变为失活型的CCR5。艾滋病的干细胞治疗策略即变成了利用类似于TALEN这种核酸酶工具敲除艾滋病病人体内造血干细胞内的CCR5基因再进行自体造血干细胞移植。近期的研究表明，多能诱导干细胞（iPSCs）因为来源广泛，易于在体外长期培养，且敲除了CCR5基因的iPSCs能够定向分化成具有全能型的造血干细胞，可作为获取CCR5缺失型造血干细胞的一种替代选择，很有应用前景。但不管是直接敲除HSCs内的CCR5基因，还是先敲除人的iPSCs内的CCR5基因再间接获得CCR5缺失型的造血干细胞，都需要将TALEN输送到细胞中进行基因敲除。而现有的以病毒或者质粒为载体输送TALEN的方法有可能引起细胞内基因的插入型突变，对于临床上的使用并不安全。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白。

本发明能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白，其特征在于，其是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为：N端-TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg-C端。

上述穿透型TAT-TALEN蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。

编码上述能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列。

为了针对内源性CCR5基因，本发明的能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链是由SEQ ID NO.1所示序列的碱基编码的，穿透型TAT-TALEN蛋白的R链是由SEQ ID NO.2所示序列的碱基编码的。该穿透型TAT-TALEN蛋白能敲除细胞内源性CCR5基因而在制备艾滋病基因治疗药物中应用。

一种内源性CCR5基因被敲除的细胞的制备方法，其特征在于，将编码上述能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列分别插入原核表达载体中，然后原核表达出能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链，将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有内源性CCR5基因的细胞孵育以敲除CCR5基因，从而得到内源性CCR5基因被敲除的细胞。

所述的孵育优选为将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有CCR5基因的细胞在37℃孵育1小时，用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30℃常规培养24小时，再与穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链混合37℃孵育1小时，再用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30℃常规培养24小时，如此再重复一次。

本发明所述的TALEN蛋白是指转录激活因子样效应因子核酸酶，其包括TALEN L链和R链。