[发明专利]一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用

权利要求书

1.一种能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白，其特征在于，其是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为：N端-TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg-C端。

2.根据权利要求1所述的穿透型TAT-TALEN蛋白，其特征在于，所述的细胞内源性基因为内源性CCR5基因，所述的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链是由SEQ ID NO.1所示序列的碱基编码的，穿透型TAT-TALEN蛋白的R链是由SEQ ID NO.2所示序列的碱基编码的。

3.权利要求2所述的穿透型TAT-TALEN蛋白敲除细胞内源性CCR5基因在制备艾滋病基因治疗药物中的应用。

4.权利要求1所述的穿透型TAT-TALEN蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。

5.编码权利要求1所述的能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列。

6.一种内源性CCR5基因被敲除的细胞的制备方法，其特征在于，将编码能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，和R链的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，分别插入原核表达载体中，然后原核表达出能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链，将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有内源性CCR5基因的细胞孵育以敲除CCR5基因，从而得到内源性CCR5基因被敲除的细胞。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的孵育为将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有CCR5基因的细胞在37℃孵育1小时，用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30℃常规培养24小时，再与穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链混合37℃孵育1小时，再用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30℃常规培养24小时，如此再重复一次。