[发明专利]一次性鉴别羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的PCR检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本项发明技术将分子生物学技术应用于食品检测领域，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计种属特异性引物，通过多重PCR反应和核酸电泳技术检测绵羊、家猪、家鸡、家鸭的肉样品。 

背景技术

线粒体DNA(Mitochondrial DNA) 是动物体内唯一存在的核外遗传信息载体，为双链的闭合环状分子，为严格的母系遗传，在高等动物中结构基本一致，大小为16 kb左右，有37个基因（细胞色素C氧化酶的三个亚基 COⅠ、COⅡ、COⅢ的基因，细胞色素b的基因，两个编码 ATP 合成酶亚基 ATPase6 和 ATPase8 的基因，NADH脱氢酶的7个亚基的基因 以及2个rRNA 基因和22个tRNA基因），另外还有一段和复制转录有关的控制区D-loop。 

线粒体DNA进化速度较快，因而具有很强的种属特异性，并且由于具有分子量小、结构简单稳定、不与组蛋白结合、存在广泛、拷贝数极多、易于操作和分析的优点而受到青睐。线粒体DNA最早用于动物检材的种属鉴定是在法医和考古领域，近年来也被试图用于动物源食品、饲料检测，特别当检材是熟制品或成分复杂的混合物时，蛋白质分析技术和免疫方法显得无能为力，线粒体DNA的PCR检测则显示出优越性，即使经过高压、蒸煮等处理也会有少量线粒体DNA完整保存下来，经PCR反应扩增百万倍后可经电泳显带，或用更灵敏的实时荧光PCR检测出来。 

目前用于种属鉴定的分子生物学方法有: 随机扩增多态性DNA分析 (RAPD) 、限制性片段长度多态性分析 (RFLP)、扩增片段长度多态性分析 (AFLP)、种属特异 PCR 技术等。 

PCR-RFLP 技术结果准确, 操作简单, 同时对试验设备要求较低, 冯强等采用PCR-RFLP 技术对cyt b基因在人及动物间差异进行了研究, 结果表明, 在15 种常见动物中,狗线粒体DNA 有微弱的非特异性扩增产物；对鸡、蛙、鸭、鱼、马线粒体DNA 无扩增产物。根据扩增产物的有或无,可初步区分人与狗、鸡、蛙、鸭、鱼、马。扩增产物经Alu I酶切后, 除鳝鱼及人的扩增产物不被酶切外, 牛、猪、羊、猫、猴、兔、豚鼠和鼠均有不同变化。Zehner等采用相同的引物扩增不同动物线粒体DNA 后, 联合应用内切酶Alu I和Nco I酶切扩增产物, 人类cyt b基因的981bp 片段被Alu I酶切, 产生978bp和3bp 片段, 除鸡和火鸡外, 其他动物cyt b基因酶切片段与人类cyt b基因酶切片段明显不同。Nco I可以酶切鸡和火鸡cyt b基因而不酶切人类cyt b基因。 

种属特异 PCR是根据扩增的目的基因设计高特异性引物，包括单一或多种属特异性引物，相应的扩增产物就有单一和多种种属目的片段。常规 PCR 技术一次只能扩增一个目的片段。在肉制品检测中, 混合肉的成分比较复杂, 必须对成分的不同动物源性同时进行检测。若是用单一PCR 分开检测这几个项目, 就存在操作繁琐, 耗时费事和试剂消耗大等缺点。Matsunaga等建立多重 PCR 技术, 通过 7 种按适当比例混合的引物, 用一次 PCR 同时对食品中的 6 种肉——牛肉、猪肉、鸡肉、山羊、绵羊和马肉中限制性 DNA 片段进行检测, 其中 7 种引物包括一条用线粒体色素细胞 b 基因设计的正链引物和 6 条各物种的特异性的DNA引物，反应采用35个循环进行PCR 扩增, 从山羊、鸡、牛、绵羊、猪和马肉的扩增产物中分离出长度分别为 157, 227, 274, 331, 398 和 439bp的 DNA 片段, 从而根据 DNA 片段的长度来鉴别混合肉制品的动物源性。张娟等克隆出了鸭线粒体DNA COⅢ基因（Genbank accession:DQ655706），利用BLAST软件、Bioedit软件分析线粒体DNA序列，根据鸭线粒体DNA COⅢ基因的特异性，设计引物（5-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3′）、（5′-TACCAACCCCCGAACTA GGC-3′），利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226bp。王丽媛等根据线粒体细胞色素b基因设计一条共用的上游引物，根据种属差异设计其下游引物，然后通过多种类引物的合理配比，可以同时对样品中的多种动物源成分进行鉴定。