[发明专利]一次性鉴别羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的PCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.为了鉴别羊肉、鸭肉、猪肉、鸡肉，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列，针对每种动物分别设计各自的种属特异性引物，分别以羊、猪、鸡、鸭4种动物的全基因组DNA为模板，通过PCR反应得到4种长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，4种长度不同的条带可以在电泳图中分辨出来。4种动物对应的4对引物序列为： 

羊： 

S-1:5′-GGCTCTCTCCTAGGCATTTGCTT-3′ 

S-2:5′-AGTTGTCTGGGTCTCCGAGTAA-3′扩增片段大小为667bp 

猪： 

P-1:5′-ACCCAGCAAGCCCAGAATCAACCG-3′ 

P-2:5′-CGAGATTGTGCGGTTATTAATGAGTCG-3′扩增片段大小为196bp 

鸡： 

C-1:5′-AATCGCAGGTATTACTATCATCCAC-3′ 

C-2:5′-GGTGAGTATGAGAGTTAAGCCCAG-3′扩增片段大小为148bp 

鸭： 

D-1:5′-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3′ 

D-2:5′-GCCTAGTTCGGGGGTTGGTA-3′扩增片段大小为226bp。 

2.为了能够一次性的鉴别羊肉、鸭肉、猪肉、鸡肉，以及混合过的肉制品中的这四种肉的成分，反复试验得到4种单PCR反应共同的反应条件为： 

预变性94℃5min 

循环94℃30s 

    58℃30s 

    72℃30s共30个循环 

延伸72℃10min冷却，电泳检测 。

3.为达到四重PCR反应的最佳扩增效果，将S-1、S-2、P-1、P-2、C-1、C-2、D-1、D-2共8种引物的原液（浓度各为10μmol/L）按照1:1:1:1:1:1:2:2的比例混合得到混合引物，即得到的混合引物中S-1、S-2、P-1、P-2、C-1、C-2、D-1、D-2的浓度为1、1、1、1、1、1、2、2μmol/L。PCR反应体系为： 

总体积20μl，2×PCR反应液10μl（含Taq DNA聚合酶、4种dNTP等，可以直接由市售的现有产品充当），混合引物2.0μl，模板DNA1.0μl，去离子水补至20μl。