[发明专利]一种检测AP2α转录因子活性的报告基因载体

说明书

  

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种携带转录因子AP2α顺式作用元件的荧光素酶报告基因逆转录病毒载体及其构建方法。 

技术背景

转录因子AP2是一个分子量为52-kDa 的转录激活因子，定位于细胞核，具有独特的蛋白质分子结构，通常以二聚体形式结合到DNA丰富GC的元件上，特异性调控基因表达，特异性调控基因表达，参与脊椎动物生长发育，细胞增殖分化，并可双向调节肿瘤的发生，而其自身也受到多种信号分子及蛋白的影响。研究发现AP2转录因子对视黄酸特别敏感，可受视黄酸信号途径的调控，在视黄酸诱导的形态发生中，AP2的mRNA水平与视黄酸敏感的发育时期呈正相关，视黄酸核受体RARs可调控AP2的表达，用拮抗剂阻止RAR功能导致胚胎小鼠眼组织中AP2阳性细胞明显减少。

现已经有5个AP2基因被确定，分别编码AP2α、AP2β、AP2γ、AP2δ和AP2??蛋白，各亚型的表达与特定的细胞类型有关。其中，AP2α与神经系统的发育密切相关。在小鼠胚胎发育中，AP2α主要表达于神经脊细胞，颅面部及脊柱的感觉神经节中，调控与周围神经系统发育相关的基因转录。AP2α敲除可导致小鼠在胚胎期死亡，并出现无脑畸形和神经管发育缺陷。AP2α还参与多种神经相关基因的调控，如：前脑啡肽原，乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱转移酶、烯醇化酶、突触蛋白、多巴胺羟化酶和儿茶酚胺合成酶等。AP2α在成年鼠脑内的表达模式提示AP2α除了在早期发育过程起重要作用外，对神经元的表型决定和功能特征的维持也有举足轻重的作用。我们的前期实验发现，全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可促进骨髓间充质干细胞向神经细胞方向，可能是通过调控AP2α的转录活性来实现的，我们希望进一步探讨AP2α的转录活性在维甲酸信号通路调控MSCs神经分化中的作用及具体的分子机制。

目前，检测AP2α的转录活性的方法是采用显性负性突变体。显性负性突变体是功能冗余的基因突变，不仅自身结构发生变化失去正常的生物学功能，还能与同一细胞内的野生型信号转导蛋白进行竞争性抑制，从而阻断野生型蛋白的生物学作用。AP2α具有特殊的蛋白结构，其N端是富含脯氨酸和谷氨酸的反式转录激活域（TAD），C端为碱性DNA结合区（basic DNA binding domain, bDBD）和碱性螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix, HLH )二聚体结构，与特异的DNA序列结合，调控下游靶基因的转录。采用缺失突变的方法分别构建缺失bHLH区域和缺失TAD区域的两个显性负性突变体腺病毒，感染MSCs，EMSA检测发现dnAP2α-△TAD对AP2α特异性顺式作用元件DNA序列的结合显著增多，由于dnAP2α-△TAD保留了DNA结合域，EMSA不能如实反映该突变体对AP2α转录活性的抑制。

发明内容

本发明的一个目的在于获得一种携带转录因子AP2α顺式作用元件的荧光素酶报告基因逆转录病毒载体，能快速、方便、准确地检测细胞中的AP2α转录因子活性。

一种报告基因载体，含有AP2α特异性顺式作用元件，其特征在于所述AP2α特异性顺式作用元件是由4个GCCCGCGGTT串联组成。

上述4个GCCCGCGG核苷酸序列的串联连接，带来对AP2α的高亲和性，但是相对的提高了产生非特异性的错误识别的几率，而影响AP2α的转录活性的检测；通过巧妙设置序列TT，使之不易在顺式作用元件内部产生错误识别。所示报告基因载体对于转录因子AP2α的特异性结合力强，且不易产生错误识别，具有高亲和力和高特异性的特点。

上述报告基因载体，含有SEQ ID NO.5所示的序列或SEQ ID NO.5互补序列。

上述报告基因载体来源于pBGLuc逆转录病毒载体。

上述报告基因载体携带天然分泌型报告荧光素酶Gaussia luciferas，以及杀稻瘟菌素抗性基因。

上述报告基因载体，其结构如图1所示。AP2α特异性顺式作用元件插入至荧光素酶Gaussia luciferase报告基因上游、5’-LTR可启动杀稻瘟菌素抗性基因的表达，抗性筛选可用于建立稳定细胞株。

本发明的另外一个目的在于提供上述报告基因载体的制备方法，主要通过以下步骤实现：

（1）体外退火获得4个串联的所述AP2α特异性顺式作用元件的DNA双链，双链两端带有BamHⅠ和MluⅠ酶切位点；