[发明专利]一种检测AP2α转录因子活性的报告基因载体

权利要求书

1.一种报告基因载体，含有AP2α特异性顺式作用元件，其特征在于所述AP2α特异性顺式作用元件是由4个GCCCGCGGTT串联组成。

2.如权利要求1所述的报告基因载体，含有SEQ ID NO.5所示的序列或SEQ ID NO.5互补序列。

3.如权利要求1或2所述的报告基因载体，来源于pBGLuc逆转录病毒载体。

4.如权利要求1、2或3所述的报告基因载体，携带天然分泌型报告荧光素酶Gaussia luciferas，以及杀稻瘟菌素抗性基因。

5.如权利要求1～4任一所述的报告基因载体，其结构如图1所示。

6.如权利要求1～5任一所述的报告基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）体外退火获得4个串联的所述AP2α特异性顺式作用元件的DNA双链，双链两端带有BamHⅠ和MluⅠ酶切位点；

（2）将上述DNA双链定向克隆至pBGLuc逆转录病毒载体，采用杀稻瘟菌素抗性基因序列及AP2α特异性顺式作用元件匹配的成对引物进行鉴定，测序正确后获得pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体。

7.如权利要求1～6任一所述的报告基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）获取AP2α特异性顺式作用元件：设计4个串联的AP2α特异性顺式作用元件序列，上游和下游序列分别符合SEQ ID NO.1 & SEQ ID NO.2的核苷酸序列，体外退火获得DNA双链；退火后形成的双链DNA片段带有BamHⅠ及MluⅠ的酶切位点;

（2）pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体的构建：将DNA双链片段定向插入至逆转录病毒载体pBGLuc的Gaussian luciferase基因上游,采用SEQ ID NO.3 & SEQ ID NO.4分别作为上游和下游引物进行鉴定；

（3）检测MSCs中AP2α的转录活性：将pBGLuc-AP2α-RE转染大鼠MSCs，腺病毒介导显性负性突变体过表达，再加入ATRA诱导24小时后检测培养上清中分泌的荧光素酶活性。