[发明专利]转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

玉米是我国重要的饲料加工原料，其所含总磷的50%以上是以植酸形式存在，动物几乎不能消化利用，同时，植酸是抗营养因子，严重影响动物对钙、镁、铁、锌等元素的吸收。植酸酶是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或盐)的一类酶的总称，能水解植酸最终释放出无机磷。在动物饲料中添加外源植酸酶可以改良磷酸盐的生物利用度，消除植酸的抗营养作用，不仅能减少磷在环境中的排泄，降低农业生态的负担，同时也能减少动物饲料中无机磷的添加，缓解我国磷资源匮乏的局面。

利用植物生物反应器生产植酸酶的研究由来已久，比如来源于WT烟曲霉的植酸酶和经过改造的热稳定植酸酶已经在小麦和大麦中成功表达；来源于无花果曲霉的植酸酶也已在烟草，苜蓿和马铃薯叶片中成功表达。我国科学家通过分离来自黑曲霉的植酸酶基因phyA2并构建到玉米特异表达载体上，得到了27个表达植酸酶并能稳定遗传的转基因玉米纯合系。其种子中植酸酶活性均在1000U／kg以上，最高达到120000U／kg，完全达到中国饲料工业标准(1kg玉米添加1000u植酸酶)的要求，可以替代传统工业生产的植酸酶添加剂。以玉米为载体生产的植酸酶直接用于饲料加工，实现了以环保、节能的农业生产方式生产“绿色磷”的梦想，具有巨大的产业优势和应用前景。

我国将转基因植物的研究分为五个阶段：实验研究阶段、中间试验阶段、环境释放阶段、生产性试验阶段、申请安全证书与商业化生产阶段。转植酸酶基因玉米是我国自主研发，具有自主知识产权的玉米品系，目前，该转基因玉米于2009年11月获得农业部正式颁发的转基因生物生产应用安全证书，成为我国首例获得安全证书的粮食作物，也是国际上首例研制成功的转植酸酶基因玉米，标志着转植酸酶基因玉米在我国即将进入大规模商业化生产阶段。根据《农业转基因生物标识管理办法》规定，转基因产品必须进行标识管理，因而需要加强转植酸酶基因玉米相关的检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用。

本发明采取的技术方案为：

一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物，正向、反向引物序列分别为：

phyA2-1F:5'-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3'，如SEQ ID NO.1所示，

phyA2-2R:5'-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'，如SEQ ID NO.2所示。

一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性探针，序列为：

phyA2-P:FAM-5'-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3'-Eclipse，如SEQ ID NO.3所示。

转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在定性检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用，方法如下：

（1）提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用phyA2-1F和phyA2-2R引物组合进行PCR扩增；

（2）上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品为含有转植酸酶基因玉米或其相关产品；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含转植酸酶基因玉米成分。

步骤（1）所述的PCR扩增为：95℃5min预变性；94℃30s,58℃30s,72℃30s,35个循环；72℃延伸7min。

所述的转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在SYBR Green I实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用，方法如下：

（1）建立植酸酶玉米phyA2基因和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线：

①提取转植酸酶基因玉米标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制植酸酶玉米phyA2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；