[发明专利]转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用

权利要求书

1.一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物，其特征是，正向、反向引物序列分别为：

phyA2-1F:5'-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3'

phyA2-2R:5'-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'。

2.一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性探针，其特征是，序列为：

phyA2-P:FAM-5'-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3'-Eclipse。

3.权利要求1所述的转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在定性检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用。

4.权利要求3所述的应用方法，其特征，步骤为：

（1）提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用phyA2-1F和phyA2-2R引物组合进行PCR扩增；

（2）上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品为含有转植酸酶基因玉米或其相关产品；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含转植酸酶基因玉米成分。

5.权利要求1所述的转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在SYBR Green I实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用。

6.权利要求5所述的应用方法，其特征，步骤为：

（1）建立植酸酶玉米phyA2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I探针实时荧光定量PCR标准曲线：

①提取转植酸酶基因玉米标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制植酸酶玉米phyA2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；

zSSIIb基因的国家标准引物序列如下：

zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'

zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；

植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物序列如下：

phyA2-1F:5'-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3'

phyA2-2R:5'-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'；

植酸酶玉米phyA2基因特异性引物扩增序列如下：

CACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACC；

（2）提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入转植酸酶基因玉米phyA2基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转植酸酶玉米phyA2基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转植酸酶玉米的百分含量。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征，步骤（1）和（2）中所述的扩增的参数均如下：扩增反应体积为20uL,2×Premix Ex Taq10uL，浓度为10umol/L的正向引物0.4uL，浓度为10umol/L的反向引物0.4uL，ddH₂O8.2uL，DNA模板1uL，扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。