[发明专利]越野他汀的生物合成基因簇及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗肿瘤抗生素越野他汀(Kosinostatin)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。 

背景技术

越野他汀(Kosinostatin)是2002年由日本科学家Tamotsu Furumai从富山湾深海中分离得到的小单孢菌Micromonospora sp.TP-A0468所产生的具有良好抗肿瘤抗菌活性的天然产物[J.Antibiot.(Tokyo)55,128–133(2002)]。2007年埃及科学家El-Naggar,M.Y.再次从链霉菌Streptomyces violaceusniger strain HAL64中分离得到[J.Microbiol.45,262–267(2007)]。 

对于革兰氏阳性菌，越野他汀具有良好的生物活性(例如对于Bacillus subtilis ATCC6633，MIC＝39ng/mL)；对于革兰氏阴性菌和酵母，越野他汀具有中等的生物活性；对于肿瘤细胞，越野他汀具有良好的生物活性(IC50约为0.10μM)，其抗肿瘤活性要优于阿霉素。 

越野他汀分子由三部分组成：蒽环骨架、含氮杂环以及酰基化的脱氧己糖单元。其中的蒽环骨架是以II型PKS的方式合成的。II型PKS由miniPKS以及相关的负责折叠、环化、氧化还原以及其他修饰的后修饰酶组成。 

阐明蒽环骨架的合成机理对于丰富人们对蒽环类天然产物的认识、改造蒽环类天然产物的合成路径以产生价值更高的“非天然”天然产物都有重要意义。 

分子的含氮杂环和脱氧糖基均是药效基团，而且结构比较新颖，但是目前的对其合成途径还不甚了解，推测其合成机制是比较独特的。因此，阐明这两个基团的合成过程，理解其生物合成的酶学机制，将大大提升人们对抗菌抗肿瘤天然产物构效关系及生物合成原理的认识。 

因此，本领域迫切需要阐明越野他汀生物合成的酶学机制，从而实现对越野他汀分子的改造，以期获得活性更高、专一性更强、毒性更低的中间体和衍生物。 

发明内容

本发明涉及具有良好抗肿瘤活性的越野他汀的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。 

本发明第一方面，提供了越野他汀的生物合成基因簇，所述基因簇包括编码越野他汀生物合成所涉及的55个基因，具体为： 

1)II型聚酮合成酶PKS相关基因：kstA1，kstA2，kstA3，kstD1，kstD2，kstD3，kstD4，kstD5，kstD6，kstD7，kstD8，kstD9，kstD10，kstD11，kstD12，kstD13，kstD14；共17个基因： 

kstA1位于基因簇核苷酸序列第9943-11505位，编码腺苷酰化酶，长度为 422个氨基酸； 

kstA2位于基因簇核苷酸序列第11507-11770位，编码肽酰载体蛋白(PCP)，长度为402个氨基酸； 

kstA3位于基因簇核苷酸序列第26548-26805位，编码酰基载体蛋白，长度为85个氨基酸； 

kstD1位于基因簇核苷酸序列第9140-9946位，编码2,3-环环化酶，长度为268个氨基酸； 

kstD2位于基因簇核苷酸序列第20823-216026位，编码酮基还原酶，长度为259个氨基酸； 

kstD3位于基因簇核苷酸序列第22658-21699位，编码芳香化酶，长度为319个氨基酸； 

kstD4位于基因簇核苷酸序列第23481-22696位，编码C-9位酮基还原酶，长度为261个氨基酸； 

kstD5位于基因簇核苷酸序列第23591-24049位，编码单氧化酶，长度为152个氨基酸； 

kstD6位于基因簇核苷酸序列第26861-27295位，编码第四环环化酶，长度为144个氨基酸； 

kstD7位于基因簇核苷酸序列第27391-28233位，编码NAD(P)H:黄素氧化还原酶，长度为280个氨基酸； 

kstD8位于基因簇核苷酸序列第28260-29156位，编码单氧化酶，长度为298个氨基酸； 

kstD9位于基因簇核苷酸序列第32267-33358位，编码羧酸酯酶，长度为363个氨基酸；