[发明专利]一种快速增殖效应淋巴细胞的制备方法及其试剂盒、用途

说明书

技术领域

本发明涉及过继性免疫疗法中快速增殖的效应淋巴细胞以及该细胞的制备方法，试剂盒制备等。本发明涉及的促进淋巴细胞中效应性淋巴细胞增殖，含有细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)的增殖激活，而调节性淋巴细胞增殖被抑制，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内以及病毒感染的免疫治疗。

背景技术

目前，肿瘤或病毒感染患者常规疗法带来的严重机体毒副作用，给以了生活品质不高，以及治疗产生的痛苦，包括化疗和放射疗法等。新的治疗模式-细胞免疫治疗为癌症或病毒患者提供高生活质量、延长生存期和无毒副作用的治疗手段。

FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS Like Tyrosine Kinase3Ligand，Flt3L)不仅对造血干细胞和造血祖细胞的增生、分化、动员、维持及长期重建具有重要作用，还能明显地促进特别是树突状细胞、淋巴细胞等免疫系统细胞的增生。而且与其它促细胞生长的细胞因子有很好的协同作用(Onai N，Obata-Onai A，Schmid MA，Manz MG. Flt3in regulation of type I interferon-producing cell and dendritic cell development.Ann N Y Acad Sci.2007Jun；1106：253-61.)，因而Flt3L能用来促进树突状细胞前体细胞分化增殖从而提高效应性淋巴细胞的增生。

针对输注由体外诱导的细胞毒T细胞(cytotoxic T cell，CTL)或外周血淋巴细胞等在IL-2和抗人CD3抗体的作用下经放大培养得到的细胞因子激活的细胞的免疫疗法中，存在着提高在体外诱导的抗原特异性CTL高效地放大培养并维持细胞毒性的问题，本发明采用了免疫细胞促进因子Flt3L进行高效增殖效应淋巴细胞并具有良好的细胞毒性。

发明内容

在效应性淋巴细胞的放大培养过程中，PBMC分化为多个性质不同的细胞群，因此放大后的细胞中的CIK细胞比例必定不高。另一方面，在分化得到的细胞中还含有具有控制或抑制免疫的功能的细胞群。本发明的目的在于提供一种癌症治疗用细胞的扩增培养方法，以及用于快速增殖效应淋巴细胞的试剂盒。采用所述方法所制备的产品中富含CIK细胞，调节性T细胞含量少。

本发明涉及快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包含如下工序，即在FMS样酪氨酸激酶3配体单独存在或与抗人CD3单抗共同存在的条件下，培养能快速增殖的效应淋巴细胞。所述效应淋巴细胞扩增倍数达到114以上。

另外，作为本发明中使用的Flt3L的优选例子，可与抗人CD3单抗共同存在下实施体外培养。此外，作为本发明的优选方式，还提供在CD3配体、干扰素-γ、白细胞介素-2以及白介素-1α的共存下实施Flt3L存在下的培养的含有CIK细胞的效应淋巴细胞的制造方法。

本发明还提供用于快速增殖的效应淋巴细胞体外培养的试剂盒，其采用本发明所记载的方法使用。

所述试剂盒包括：

A液：细胞基础培养基；

B液：干扰素-γ；

C液：白介素-2；

D液：白介素1-α；

还含FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS Like Tyrosine Kinase3Ligand，Flt3L)与抗人CD3单抗包被的培养瓶；

以及使用说明书；

Flt3L固化方法：包被的培养瓶选用25cm²或75cm²培养瓶，或塑料培养皿，或透气性培养袋，优选地，在0.1ng-100ng/mL Flt3L和0.1ug-20ug/mL抗人CD3单抗存在下(pH值7.4的1×PBS进行稀释)，4℃冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，备用。

本发明还提供所述试剂盒在制备效应淋巴细胞中的用途。

附图说明

图1表示本发明制备的效应淋巴细胞的流式细胞图；

图2表示本发明制备的效应淋巴细胞的FoxP3流式细胞柱状图；

图3表示本发明制备效应淋巴细胞与现有技术的细胞增殖倍数对比。

具体实施方式

本发明发现通过在Flt3L的存在下培养骨髓、脐带血或外周血来源的单个核细胞，在得到的效应淋巴细胞中高比例含有在细胞表面表达CD3与CD56两分子的细胞，而更低表达CD4、CD25和Fox P3的调节性T细胞，从而完成了本发明。