[发明专利]一种快速增殖效应淋巴细胞的制备方法及其试剂盒、用途

权利要求书

1.一种快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括如下工序：在FMS样酪氨酸激酶3配体单独存在或与抗人CD3单抗共同存在的固定化条件下，体外培养能快速增殖的效应淋巴细胞，所述效应淋巴细胞扩增倍数达到114以上。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在干扰素-γ、白介素-2和白介素-1α存在下，以及FMS样酪氨酸激酶3配体和抗人CD3单抗的固定化条件下实施体外培养。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，固定化方法：包被的培养瓶选用25cm²或75cm²培养瓶，或塑料培养皿，或透气性培养袋，在0.1ng-100ng/mL Flt3L和0.1ug-20ug/mL抗人CD3单抗存在下，4℃冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，备用。

4.一种快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法，其特征在于，其过程如下，包被的培养瓶选用75cm²培养瓶，使用pH值7.4的1×PBS稀释的15ng/mL Flt3L单独存在或与0.5ug/mL抗人CD3单抗共同存在下，4℃冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，制得已固定化75cm²培养瓶，备用；

采集50mL外周血或脐带血，采用Ficoll密度梯度离心分离得到的单个核细胞2-10×10⁸cells，重悬悬在含有1000U/mL IFN-γ和10％自体血浆的RPMI1640培养基中，至3-10×10⁶cells/mL，添加到上述已固定化75cm²培养瓶中，每瓶30mL，在5％CO₂中在37℃下开始培养，此时记为第1天；

第2天，向各培养瓶添加20mL含1200U/mL IL-2、400U/mL IL-1α以及40％自体血浆的RPMI1640培养基，继续培养；

第4天，向各培养瓶添加10mL的含300U/mL IL-2、100U/mL IL-1α以及10％自体血浆的完全RPMI1640培养基，继续培养；

第6天，将各培养瓶内的细胞悬浮在培养基中全部收集，转移到未固定化的150cm²培养瓶中或透气性培养袋；此时，添加完全RPMI1640培养基使每个培养瓶或每只袋子分别为100mL和600mL，在5％CO₂中在37℃下培养；

第8天和第10天，各培养瓶添加完全RPMI1640培养基进行扩瓶，每个培养瓶的培养液为150ml；或向各袋子中添加完全RPMI1640培养基300mL进行继续培养至第16天；最终每只袋子的培养液为1500mL；

培养到第16天，获得快速增殖的效应淋巴细胞，进行细胞活率和细胞表型检测；

其中，细胞活率的测试方法为：计算培养最后一天的活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较，算出放大培养率；取1mL最后一天培养的培养液，1000rpm、4℃下离心10分钟，细胞用RPMI1640培养基重悬，取20ul细胞液用1×PBS稀释20倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞；所述效应淋巴细胞扩增倍数达到114以上；

细胞表型的测试方法为：取苔盼兰染色计数后的3×10⁶细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD25单抗、20μL PE标记鼠抗人CD4单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD3单抗的离心管中；第二组分别添加20μLFITC标记鼠抗人CD8单抗、20μL PE标记鼠抗人CD56单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD3单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。

5.一种用于快速增殖的效应淋巴细胞体外培养的试剂盒，其特征在于，其采用如权利要求1-4中任一项所述的方法使用。

6.权利要求5所述试剂盒在制备效应淋巴细胞中的应用。