[发明专利]一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及分子标记检测技术领域，涉及一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法，适用于大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的鉴定。

背景技术：

大豆细胞质雄性不育“三系”由不育系、保持系和恢复系构成。不育系做母本与恢复系父本杂交，即可获得杂交种。这其中保持系和恢复系由于自身可育，种子可由自交繁殖获得；而不育系自身不育，种子只能通过其作为母本与同型保持系父本杂交获得，而不育系与同型保持系除育性外，其他农艺性状完全相同，在繁殖的过程中常常由于田间种植、收获脱粒等环节造成不育系中混杂保持系的后果。制种者利用不纯的不育系种子与恢复系杂交生产杂交种时，必然导致混入的保持系给不育系授粉，使不育系上结出的种子仍然为不育系而非杂交种。这样收获的杂交种中因混入不育系而导致不纯。这样的种子在生产上种植，必将导致生产田中出现不育株而减产，降低农民的种植积极性，种子销售公司也承担很大的违约风险。因此，保证大豆杂交种的纯度，必须从源头抓起，其中不育系种子纯度鉴定就显得非常重要。

由于不育系和保持系形态上完全一致，无法通过传统的形态学鉴定法在田间种植鉴定。近些年来随着分子标记的广泛应用，借助分子标记进行种子纯度鉴定可以克服上述方法的缺点。

发明内容：

本发明的目的是在于提供一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法，可快速、准确、可靠地通过分子生物学实验手段鉴定RN型大豆细胞质雄性不育系中混入的保持系，保证不育系种子纯度。

为实现本发明述目的，其技术解决方案如下：

（1）提取大豆RN型细胞质雄性不育系和配套保持系种子基因组DNA，以基因组DNA为模版，选用1对InDel标记，命名为“InDel-cms1”进行扩增，其引物序列为

上游引物：5’-TGGACTGACGCTTATGCTGGCGTGG-3’

下游引物：5’-GATGACTGCTGGTGCTGAAGTCACT-3’

（2）对扩增产物进行凝胶电泳，对电泳结果进行分析，其中：

InDel-cms1引物扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp。通过扩增片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分。

本发明提供的分子标记鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系种子纯度的方法，包括以下步骤： 

提取大豆RN型细胞质雄性不育系和配套保持系种子的基因组DNA；以基因组DNA为模版，利用引物InDel-cms1进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析；其中，扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp；通过片段长度差异可以将不育系和保持系准确区分，所有扩增片段与不育系扩增片段不同的均为伪不育系种子，检测得到的不育系特有长度片段个数占被检测所有种子的百分数即为不育系种子的纯度。

其中，大规模微量基因组DNA的提取，其流程是：

取一粒不育系或保持系种子，在种脐背部切取直径为2.0mm，深1.5mm小块，放入1.5mL离心管加入液氮研磨成粉末，采用改进型SDS法提取基因组DNA，提取完成后置于-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增反应： PCR反应体系为15μl，其中包括基因组DNA 30 ng，2×Taq Mix 7.5μl，引物0.2μmol·L^-1，其余部分用ddH₂O补齐。PCR反应程序：首先94℃ 4min；然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共32个循环；最后72℃ 5 min。PCR扩增反应在基因扩增仪上进行。

凝胶电泳：扩增产物在浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，100V电压电泳50min后，在凝胶成像仪上照相记录结果。

本发明与传统不育系纯度鉴定方法相比具有以下优点和效果：

（1）DNA提取方法新颖，不伤害种子，取样后的种子仍可种植。

（2）DNA提取及电泳检测快速、准确，仅需一个工作日即可完成。

（3）操作方法简单，普通实验室技术人员就可完成。

（4）所需设备为普通分子生物学实验室常用设备。

（5）没有季节和时间限制，任何时间皆可进行检测。

（6）解决了因不育系和保持系表型相同，二者无法通过传统田间种植鉴定法鉴定的问题。